学术前沿|中科睿极首席科学家张智勇教授团队研究成果:持续营养供应培养体系，让干细胞外泌体开启抗光老化新赛道

紫外线照射引发的皮肤光老化，是导致皮肤皱纹、粗糙、色素沉着的主要诱因，传统治疗难以从分子层面逆转损伤。在再生医学领域，间充质干细胞（MSCs）及其分泌的细胞外囊泡（EVs）一直是研究热点。这些微小的囊泡承载着干细胞的核心信号分子，在组织修复、抗衰等领域展现出巨大潜力。然而，传统的血清饥饿培养法（Serum starvation culture，SC）在收集 EVs 时，往往会导致干细胞凋亡、自噬异常，不仅降低 EVs 产量，还会影响其治疗效果。

对此，中科睿极首席科学家张智勇教授团队在国际期刊《Journal of Tissue Engineering》发表重要成果（论文标题：Continuous nutrient supply culture strategy controls multivesicular endosomes pathway and anti-photo-aging miRNA cargo loading of extracellular vesicles）。团队创新性提出持续营养供应培养（continuous nutrient supply culture，CC）策略，通过优化 MSC 培养微环境，让外泌体的产量、质量与抗光老化活性实现三重提升，为 MSC-EVs 无细胞疗法的临床转化提供了全新技术路径。

核心突破：持续营养供应让外泌体 “效能翻倍”

为破解传统血清饥饿培养法这一难题，研究团队通过构建了 “持续营养供应培养（CC）” 与 “血清饥饿培养（SC）” 两大体系，从细胞状态、外泌体产量、功能活性等多维度展开系统对比，验证新型培养策略的优越性。

实验设计

一、持续营养供应培养（CC）体系构建

培养基选择：采用 UltraMedia^® 无血清培养基（REGEN-αGEEK, China），添加 1% 青霉素/链霉素（P/S）。

营养供应：持续补充生长因子、白蛋白等必需营养，培养基成分与浓度明确，避免动物源外泌体干扰。

培养流程：将脐带组织块接种于上述培养基，在 37℃、5% CO₂培养箱中培养；当原代细胞生长至 80% 汇合度时移除组织块，后续传代仍使用相同无血清 + 持续营养供应体系；细胞达 80% 融合时直接收集上清液，细胞可继续传代复用。

二、血清饥饿培养（SC）体系构建

研究成果1

首先，通过超速离心法成功分离出 CC-EVs 与 SC-EVs，进行系列表征实验。实验结果表明，两者均具有圆形双层膜结构、30–150 nm典型粒径， 均表达 CD9、CD63、CD81、TSG101 等经典外泌体阳性标志物，且无杂质蛋白钙联蛋白（Calnexin）表达，证明分离得到的为高纯度外泌体（Figure 1a-d）。其中两者的关键差异在于产量，相同体积细胞上清液经相同方法分离后，CC-EVs 的蛋白浓度显著高于 SC-EVs，反映其分泌量更丰富（Figure 1e）。每株 CC-MSC 可分泌约 2.4×10⁵个外泌体，是 SC-MSC 分泌量的 1.4 倍（Figure 1f）。CC-EVs 的颗粒浓度达1.4×10¹² particles/mL，远高于SC-EVs的6.4×10¹¹ particles/mL，且在30–150 nm 的核心粒径范围内，CC-EVs 的颗粒数量优势更为明显（Figure 1g-h）。综上证实：持续营养供应培养（CC）策略在不改变外泌体基本特性的前提下，能显著提升 MSC 外泌体的产量与浓度，为其后续功能优势奠定了基础。

研究成果2

为了研究CC策略促进EV形成的机制，首先考察了不同MSCs培养方法对细胞状态的影响。与血清饥饿培养（SC）相比，持续营养供应培养（CC）能显著抑制 MSC 的自噬（自噬标志物 LC3 II 表达降低）和凋亡（总凋亡率仅 0.115%，较 SC 组下降 2.85%），维持细胞稳态（Figure 2a-d）。同时CC 策略可上调内体分选复合物（ESCRT）核心蛋白（HRS、TSG101）及膜转运蛋白 Rab27a/b 的表达，通过调控多泡体通路，为外泌体前体形成与释放提供关键分子基础。

研究成果3

与 SC 组相比，CC-MSC 细胞膜表面的四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）含量更低，但细胞整体的四跨膜蛋白总含量更高，表明 CC 策略促进含这类蛋白的细胞膜内吞（Figure 3a-d）；透射电镜观察显示，CC-MSC 内的外泌体前体（多泡体，MVE）数量更丰富、形态更成熟，且每个多泡体内的腔内囊泡（ILV）更多，证实 CC 策略通过加速膜内吞促进外泌体前体形成（Figure 3e-f）。综上表明，CC策略通过促进含四跨膜蛋白的细胞膜内吞，加速多泡体（外泌体前体）的形成，为后续外泌体的高效释放奠定结构基础。

研究成果4

PKH26 荧光标记实验显示，CC-EVs 与 SC-EVs 均可被人表皮成纤维细胞（HEFs）成功摄取，荧光颗粒聚集于细胞质中，为后续功能发挥奠定基础（Figure 4a）。CCK-8 检测与 BrdU ELISA 验证表明，两种外泌体均能改善 UVB 损伤 HEFs 的增殖活性，但 CC-EVs 效果更显著（Figure 4b-c）。细胞划痕实验显示，光老化 HEFs 伤口愈合缓慢，而 CC-EVs 处理组的划痕愈合率明显高于 SC-EVs 组，证实 CC-EVs 更能加速损伤细胞的迁移修复（Figure 4d-e）。

研究成果5

β-半乳糖苷酶（细胞衰老关键标志物）染色显示，UVB 诱导的光老化HEFs经 EVs处理后，衰老阳性细胞率显著降低，且 CC-EVs 的抑制效果优于 SC-EVs（Figure 5a-b）。CC-EVs 可显著下调光老化 HEFs 中基质金属蛋白酶 1（MMP-1）的表达（减少胶原降解），同时上调 Ⅰ 型胶原蛋白合成，逆转 UVB 导致的胶原代谢紊乱（Figure 5c-d）。UVB 照射会升高光老化细胞中p53蛋白（DNA 损伤相关蛋白）的表达，而 CC-EVs处理能有效降低 p53 水平（Figure 5e-f）。综上表明，与 SC-EVs 相比，CC-EVs 能更显著地抑制 UVB 诱导的光老化 HEFs 衰老、调控胶原代谢平衡并修复 DNA 损伤，展现出更优的体外抗光老化修复活性。

研究成果6

UVB 诱导的光老化小鼠经3周治疗后，CC-EVs 组小鼠背部皮肤粗糙度显著降低，晒伤导致的瘢痕与溃疡完全消失，皮肤状态接近正常；SC-EVs 组也有改善，但效果弱于 CC-EVs 组（Figure 6a-b）。HE及Masson染色显示，CC-EVs 组小鼠表皮厚度显著变薄，皮下胶原纤维再生并有序排列，皮肤附属器恢复均匀分布，逆转 UVB 导致的胶原紊乱（Figure 6c-d）。其中分子调控机制可能为通过调控 NF-κB通路抑制慢性炎症并促进胶原再生，展现出更优的体内抗光老化修复效能（Figure 6e-f）。

研究成果7

miRNA组学分析显示：CC-EVs 与 SC-EVs 的 miRNA 表达谱可被清晰区分，两组外泌体携带的miRNA 组成存在本质差异（Figure 7a）。Venn图显示，CC-EVs 含663种 miRNA，SC-EVs 含 552 种，共有的 miRNA 为 440 种，CC-EVs 独有的 miRNA 达 223 种（较 SC-EVs 多 112 种）（Figure 7b）。其中，两组外泌体存在125 种显著差异表达的 miRNA，CC-EVs中46 种上调（占 83.6%）， 9 种下调（占 17.4%），差异倍数达2倍以上（Figure 7c）。构建的miRNA-NF-κB 信号通路相互作用网络显示，CC-EVs 中富集多种抗衰miRNA（如 miR-493-3p、miR-196a-5p）可靶向 TNF-α 等基因，抑制 NF-κB 通路激活，进而下调 MMPs、β-半乳糖苷酶等衰老相关分子，减轻慢性炎症与氧化应激，这也是其治疗效能优于SC-EVs 的核心分子机制（Figure 7d-f）。

结论

该研究创新性提出的持续营养供应培养策略，不仅解决了传统血清饥饿培养的诸多弊端，更通过调控MSC细胞状态与外泌体装载cargo，实现了外泌体产量与功能的双重优化。尤为重要的是，CC-EVs 通过富集抗衰 miRNA 靶向抑制 NF-κB 通路，为皮肤光老化治疗提供了精准高效的分子机制。

临床意义：从实验室到产业化的跨越

本研究不仅为MSC-EVs的质量控制提供了新思路，更为其工业化生产指明方向：

成本效益：CC策略缩短培养周期，提高细胞利用率，降低生产成本。

质量可控：化学成分明确的培养基（购自中科睿极UltraMedia^®无血清培养基系列，REGEN-αGEEK）避免动物源性EVs污染，符合GMP标准。

疗效优化：维持细胞生理状态确保EVs组成稳定，提升治疗可预测性

未来，结合三维培养、切向流过滤技术以及CC策略，有望实现MSC-EVs的规模化、标准化生产，推动其在皮肤抗衰、慢性炎症性疾病等领域的临床转化。