摘要
糖尿病患者的骨缺损愈合过程中持续受到高血糖的阻碍，骨再生面临着较大挑战。受高血糖条件下内质网过度应激和功能障碍导致成骨障碍的启发，研究人员采用具有自愈性、生物粘附性的高性能水凝胶负载工程化外泌体，通过实验表明，这种工程化外泌体能有效调节内质网稳态，显著改善体内间充质干细胞（MSC）在高血糖环境中的功能，促进成骨。
背景介绍
内质网在骨稳态和骨病中发挥关键作用，而糖尿病性高血糖可在多种组织中诱导内质网应激，导致细胞功能受损和病理生理改变。为有效修复糖尿病高糖微环境中的骨缺损，基于内质网调节的治疗有望成为一种潜在的高效策略。
研究人员发现，MSC来源的外泌体（Exo）的治疗作用与内质网应激的调节密切相关，已有报道，骨髓MSC-Exo可下调髓核细胞的内质网应激，改善椎间盘退变。然而，目前尚不清楚MSC-Exo能否促进糖尿病骨愈合过程中的细胞内质网稳态。此外，单独使用外泌体是否能获得满意的治疗结果也具有挑战性。
治疗策略
为实现糖尿病骨愈合，研究人员构建了一种新型的装载Sephin1（Sep）的工程化外泌体(Sep@Exo)，调节内质网稳态并在高血糖中修复受损的MSC。
Sep是一种安全且具有特异性的小分子，主要起蛋白质折叠，维持内质网蛋白酶沉积，下调内质网应激；而Exo是由细胞衍生而来的天然纳米囊泡，负责物质运输和细胞间通信，在高效传递治疗药物中具有明显优势，故采用Exo作为Sep的体内递送载体。另外，考虑到多频给药的麻烦，研究人员合成一种固定外泌体的生物材料支架——基于透明质酸（HA）水凝胶。水凝胶是一种亲水性、多孔性、软性的材料，由高含水量的三维聚合物网络组成，可以模拟细胞外基质。
图1：A.水凝胶负载工程化外泌体的制作过程(Sep@Exo);B.将Sep@Exo注入糖尿病大鼠股骨缺损，促进骨再生。
图2：工程化外泌体的构建与表征。B.TEM分析显示，Exo和Sep@Exo均表现出典型的杯形或球形形态；C.Western blot分析证实，Exo和Sep@Exo含有CD9 、CD81、Alix和TSG101特异性标志，而没有Calnexin；D.尺寸分布显示，Exo和Sep@Exo的直径相似，范围在40-160nm之间；E.间歇性超声方法的载药效率显著提高；F.免疫荧光分析显示，Exo和Sep@Exo均能被MSC有效内化。
研究结果
工程化外泌体对受损MSC的治疗作用
使用浓度为50 μg mL−1的Exo和50 μg mL−1的Sep@Exo（含1μm Sep）修复高血糖下受损MSC的功能。结果显示，与高糖（HG）组相比，HG-Exo组与HG-Sep@Exo组的MSC细胞活力（图3G）和增殖率（图3H，I）均提高，而HG-Sep@Exo则表现更优。流式细胞术凋亡检测显示，HG-Sep@Exo组的MSC凋亡率几乎恢复到正常（图3J，K）。
图3：Exo修复受损MSC的实验结果
外泌体减轻内质网应激
内质网功能障碍相关基因和蛋白表达在HG-Sep@Exo组显著降低（图4A，B）。免疫荧光染色显示，CHOP和C-CAS3蛋白表达的同步下降，说明Exo有利于MSC抵抗内质网应激相关而引发的凋亡（图4C）。在诱导成骨培养基下培养时，Exo组的ALP活性、矿化结节形成明显改善（图4E-H），而Sep@Exo更有效地增强MSC的成骨功能（图4D，I）。GRP78和ALP的双染色表明，经Exo处理后，受损MSC的成骨能力随内质网稳态的恢复而显著增加（图4J）。Sep@Exo组的内质网形态与对照组几乎相似（图4K）。
图4：外泌体减轻内质网应激的实验结果
外泌体减少ROS的产生
受损的线粒体是细胞活性氧（ROS）的主要来源，过量的ROS是导致内质网功能障碍的直接因素。利用荧光探针检测各组细胞中ROS的表达，结果显示HG组的ROS含量显著增加，Exo组和Sep@Exo组中则均显著下调（图5A，B）。Exo通过激活线粒体自噬发挥作用（图5C-E），而线粒体自噬不受Sep加载的显著影响。
图5：细胞内ROS检测以及线粒体自噬相关实验结果
外泌体通过直接传递SHP2蛋白发挥治疗作用
SHP2是一种与parkin相互作用，正向调节线粒体自噬的蛋白。Western blot检测结果显示，Exo组和Sep@Exo组中的SHP2蛋白水平明显上调（图6A，B）。为验证SHP2有助于诱导线粒体自噬、ROS减少、内质网应激缓解和修复受损MSC，团队研究SHP2传递的阻断是否会阻碍外泌体诱导的治疗效果，结果显示，Exo直接将SHP2蛋白传递给MSC，激活线粒体吞噬和清除线粒体ROS，最终维持内质网稳态（图6C-Q）。
图6：Exo激活线粒体吞噬和清除线粒体ROS的实验结果
动物实验
水凝胶负载工程化外泌体增强糖尿病骨再生
为评估水凝胶负载工程化外泌体的治疗潜力，我们通过高脂肪饮食和STZ诱导建立了2型糖尿病大鼠模型。然后将不同组的水凝胶注入大鼠糖尿病股骨缺损液中，水凝胶（Gel）组作为对照（图7A）。结果显示，植入8周后，Gel-Sep@Exo组在缺损中可见大量新骨填充，再生能力最强，而空白组仅观察到少量新骨，表明骨愈合延迟（图7B，C）。
安全性方面，在模型鼠的主要代谢器官（包括肺、心、肾、肝和脾）中均未观察到病理异常，表明水凝胶和Sep@Exo具有良好的体内生物相容性。
图7：糖尿病大鼠模型的构建和Gel-Sep@Exo在模型鼠内骨分化的实验结果
研究结论
一方面，Sep分子直接减轻内质网应激；另一方面，Exo中固有的SHP2蛋白通过激活线粒体自噬，减少ROS的产生，双方协调和合作，发挥了维持内质网稳态和加速骨生成的治疗作用。该研究表明，这种新型的水凝胶包封工程化外泌体策略具有临床应用的潜力，并可能进一步启发其他创新治疗方法的发展。
参考：
1. Liu, Yulan et al. “High-Performance Hydrogel-Encapsulated Engineered Exosomes for Supporting Endoplasmic Reticulum Homeostasis and Boosting Diabetic Bone Regeneration.” Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany) vol. 11,17 (2024): e2309491. doi:10.1002/advs.202309491
END
