硫代磷酸酯键（PS）是极为重要的寡核酸药物化学修饰。这种修饰是将常规的磷酸二酯键（PO）骨架中的一个非桥接氧替换为硫，使寡核酸能够抵抗核酸酶（nuclease）的降解，也能促进寡核酸的细胞摄取。此外，PS修饰引入了两种立体异构体：Rp和Sp。两者间的差异也会改变PS寡核酸药物的性能。因此，PS构型控制引起了核酸相关学术圈和产业圈的广泛关注。本文将通过介绍：（1）PS键的特性；（2）Rp和Sp的区别；（3）PS构型控制的案例，为读者详细介绍PS修饰重要性以及应用前沿。
1966年，科学家在合成含有PS键的【腺苷5‘-磷硫酰】时无意间发现：含有PS键的5‘-磷酸能够抵抗磷酸酶的降解。后续研究发现，如果将ATP的三磷酸最外侧的PO替换为PS，就可以让其抵抗ATP酶和磷酸酶降解。
PS键对酶解的抵抗主要源于：（1）硫原子的空间效应；（2）磷酸负电荷分布的改变。相比于氧原子（0.48 Å），硫原子有更大的原子半径（0.88 Å）。部分核酸酶需要金属离子辅因子（cofactor），如Klenow核酸酶。当Klenow与PS寡核酸结合时，硫的空间阻碍效应会将金属离子挤出，并降低酶解活性。
另一方面，常规的PO键含有一个带负电荷的氧原子（O-），O-与辅因子或酶活性位点形成静电相互作用。而PS替换PO会对电子密度和负电荷分布产生影响，原因是S相比O的电负性较低。这种变化会影响静电结合，也使磷更难以被亲核进攻（即酶的亲核基团或辅因子进攻磷酸基团，导致磷酸酯键断裂），从而抑制酶解。
图1：PS修饰对酶解的抵抗，来源：Nucleic Acid Ther., 2014, 24, 374.
上述的硫空间阻碍效应是和PS键空间构型相关的。如果是Rp，则Klenow核酸酶依旧能够剪切。而Sp则会更好地抵抗酶降解。由此可见，PS键的立体构型对寡核酸抗降解影响巨大。
图2：PS修饰和它的两种立体异构体，来源：Signal transduct. target. ther., 2020, 5, 101.
Rp和Sp绝对构型是遵循Cahn-Ingold-Prelog命名规则。该规则使用方式如下：首先，确定手性中心后，将四个取代基按照原子序数排列优先度（如-H取代基优先度最低，-O其次，-S最高；如果优先度相同，再看取代基上第二个原子，如-CH3优先度低于-COOH）；然后将优先度最低的忽略，剩下三个按照优先度顺序形成顺时针则为R构型，逆时针则为S构型。
图3: 绝对构型（absolute configuration）命名规则，来源：网络。
除了对酶解抵抗能力的区别之外，Rp和Sp在寡核酸药物的反义（antisense，与RNA靶标互补并引导RNase降解靶标）应用中也有区别：（1）Rp构型PS寡核酸与RNA形成的复合物的双链稳定性更高（更高的熔解温度，melting temperature）；（2）Rp也能更好的激活RNase H。
由上述内容可以看到，Rp和Sp对于寡核酸药物，尤其是ASO药物会有各方面的影响。另一方面，如果一个寡核酸药物含有数量为n的PS修饰，则理论上会有2n种构象异构体。当n≥17，立体异构体的数量就会超过100000个，为寡核酸药物的治疗效果和安全性带来极大的不可预测性。因此，PS键立体构型的控制是寡核酸药物生产的关键需求之一。
Wave Life Science是一家致力于PS构型控制的寡核酸药物公司。迄今为止，该公司已参与发表7篇有关论文。本文将挑选一个典型案例进行解析，并汇总归纳7篇工作的特点。受限于篇幅，其中涉及PN修饰（phosphoryl guanidine）不予单独展开讨论。
SOSICS合成方法
该公司的代表工作之一是于2017年发表在Nature Biotechnology的可规模化SOSICS法（stereocontrolled oligonucleotide synthesis with iterative capping and sulfurization），即：具有迭代封端和硫化的立体控制寡核酸合成法。SOSICS法克服了以往PS构型控制手段的缺陷，包括使用oxathiaphospholane单体的低耦合效率，使用oxazaphospholidine单体的低PS构型选择率，和使用N-acyl oxazaphospholidine单体的长度限制（< 12 mer）等等。
SOSICS法使用了立体化学纯的oxaphospholidine单体进行四步循环法合成：（1）偶联。这一步具有高化学转化率（耦合效率），并使立体构型倒置（inversion，Sp变Rp）；（2）封端。该步骤同时将手性助剂上的吡咯烷氮酰化，辅助下一步的手性助剂脱离；（3）硫化。脱去手性助剂，保留立体构型的同时完成硫化修饰；（4）脱DMT（5′-dimethoxytrityl）保护基，进行下一个循环。
图4: SOSICS法使用的单体，来源：Nat. Biotech., 2017, 35, 845.
PS构型独立控制
SOSICS方法除了高耦合效率和可规模化等优势，最大的特点就是能够通过每一步耦合，精准控制每一个PS键的立体构型。基于这一特点，该工作合成了多种Mipomersen（FDA批准ASO药物，理论具有50万种以上的立体化学异构体）的立体化学纯产物，即只有一种异构体。
独立控制带来的优势
对上述合成的各种Mipomersen异构体进行体外实验和动物实验，该工作得出了以下结论：
（1）Sp会增加ASO在体外的亲脂性和稳定性。将Sp置于ASO的gapmer末端，可以替代2‘-MOE的提升稳定性作用；
（2）在DNA区域修饰SpSpRp连接（SSR码）可以提升药物体内/体外活性。这是传统的全Rp或全Sp控制（非独立控制）无法达到的效果;
（3）带有SSR码的异构体比Mipomersen有更持久的效果;
（4）部分独立控制的异构体展现出比Mipomersen还要低的药物活性，证明了独立控制PS构型可以避免产生不活跃成分，从而减少药物剂量和毒性;
（5）传统ASO药物使用异构体混合物（不控制PS构型）的原因是Sp有更好的稳定性，而Rp有更好的活性。该工作证明了通过独立控制来精准编码PS构型，能够使用立体化学纯异构体（单一异构体）同时实现更好的稳定性和更好的活性。
应用汇总
Wave Life Science在这篇工作后，陆续发表了数篇立体化学纯ASO和其他药物的研究工作。如下表所示，立体化学纯PS和PN修饰联用形成嵌合骨架（chimeric backbone）也能显著改善各种药物效果。
表格1：Wave life science 的寡核酸药物PS构型控制研究
1. splice-switching oligonucleotides，ASO的一种，通过和pre-mRNA结合来改变mRNA的剪接模式，如外显子跳跃（exon skipping）
2. phosphoryl guanidine，磷酰胍修饰
3. A-to-I编辑
4. mHTT = 突变huntingtin拷贝，wtHTT = 野生型huntingtin拷贝
PS修饰的引入显著提升了寡核酸药物的稳定性与功能。而 Rp和Sp立体异构体对药物性能的不同影响使得构型精确控制成为研发中的关键。现代化的合成技术SOSICS法实现了PS键立体构型的独立控制，为优化药物活性、减少毒性和提高治疗效果提供了新方向。
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