CRISPR-Cas技术在基因编辑领域的广泛应用，正在推动sgRNA合成需求的快速增长。然而，传统的SPOS（solid-phase oligonucleotide synthesis, 固相合成寡核酸）法难以匹配这一需求增长。其原因是SPOS法用于长达约100 nt的sgRNA时，难以确保sgRNA引导区的保真度（fidelity）。不仅如此，由于sgRNA具有高密度的化学修饰和复杂的二级结构，SPOS法也难以达到较高的纯度和产率。
经过精心布局，兆维科技深入开发的酶连接（Ligation）合成技术已用于双价siRNA高纯度合成（详见上篇）。本文作为该技术运用案例的下篇，将继续介绍兆维科技的sgRNA合成案例，旨在展现双步酶连接法如何确保sgRNA引导区的保真度，并凸显酶连接技术在基因编辑药物开发中的潜力！
由Intellia Therapeutics开发的sgRNA能引导CRISPR-Cas对TTR（transthyretin，转甲状腺素蛋白）基因的编辑，实现hATTR（hereditary transthyretin amyloidosis，遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性）的治疗。本次案例研究以Intellia G211 sgRNA为研究对象，它的结构包含了一个与目标基因互补的引导区、一个repeat/anti-repeat区、和一个含有多茎环的结构稳定区（图一）。它的一大特点是在多个位置引入2'-OMe修饰，并在两端引入PS（phosphorothioate，硫代磷酸酯）修饰。这些修饰可显著增强其在体内的稳定性与活性。
图一：G211 sgRNA的化学修饰和结构，以及其Ligation合成的分段策略。
然而，G211 sgRNA的复杂性给SPOS法带来了以下挑战：（i）因为SPOS法是由3’端→5’端的方向进行，所以20 nt引导区的合成发生在SPOS流程的末期。由于反应步数的累加，这段序列的保真度就难以控制，也意味着脱靶风险；（ii）SPOS法合成100 nt的G211 sgRNA需要约400步反应，这会导致SPOS产生的sgRNA杂质极为复杂，也会降低sgRNA的产率。
不同于SPOS一次性合成100 nt，兆维科技的双步酶连接法将sgRNA分成了3条片段（图一），每段只需SPOS一次性合成40 nt。因此，每条片段的杂质会更加简单，其纯度和产率也会更高。不仅如此，将sgRNA分割为3条片段分别合成也能减少二级结构对SPOS的干扰。最为重要的是，双步酶连接法还包括了独立的引导区酶连接步骤，以此确保引导区的保真度。
引导区的酶连接合成流程包括以下步骤：
（1）第一，通过SPOS分别合成2条引导区片段（片段1a和1b）；以及1条20 nt的DNA模板（模板1*，图二A）。
（2）第二，片段1a和1b与模板1*互补杂交构成酶连接位点（图二B）。
（3）第三，使用连接酶（Ligase）连接1a和1b，形成完整的片段1（图二C）。
（4）第四，使用DNase降解DNA的模板1*，保留RNA的片段1（图二D）。
图二：20 nt引导区的Ligation合成步骤。“*”代表互补的意思。
如图三A所示，在完成片段1的合成后，通过SPOS合成另外两条片段（片段2和3），然后再合成2条DNA模板（模板1*2*和2*3*）去连接片段1、2和3。在模板的帮助下，3条片段的酶连接是通过一锅法完成的。最后再用DNase降解2条模板，得到完整的sgRNA。
片段1和2都和模板完全互补，而片段3仅与模板部分互补，原因包括：（i）若完全互补，模板2*3*长度需要增加至60 nt，这会导致其合成纯度和产率的下降；（ii）模板2*3*的长度已足够确保其与片段3的互补特异性，排除杂质的干扰。
图三：G211 sgRNA的酶连接合成方法（A）以及各个片段和模板的纯度（B）。
兆维科技为模板和片段选择了不同的纯化策略。如图三B所示，所有的片段都采用了HPLC纯化，但模板仅采用UF/DF（ultrafiltration/diafiltration，超滤/渗滤）。这么做的原因是sgRNA产物的纯度主要由片段1-3决定，而且模板杂质最终会被DNase降解。可以看到即便模板1*2*的纯度只有70.4%，sgRNA产物的纯度也高达96.8%（DNAse降解和HPLC纯化后）。而省去模板的过柱纯化可以减少合成成本。
本案例中，酶连接合成双价G211 sgRNA展现了以下特点和优势：
（1）引导区的高保真。双步酶连接法是将引导区的酶连接作为第一步，完整sgRNA的酶连接作为第二步。这种策略能将引导区的SPOS合成长度压缩到10 nt左右，从而实现极高的纯度（>98%，图三B），并进一步实现引导区的高保真。
（2）更高的sgRNA纯度。两步法实现了96.8%的纯度，远高于SPOS能够得到的纯度（60-80%）。不仅如此，酶连接法通过大幅度降低SPOS的合成长度（100 nt → 40 nt），也能减少sgRNA杂质的复杂性。
（3）更高的产率和更低的成本。与双价siRNA的情况类似（详见上篇），sgRNA采用酶连接合成能得到更高的终产品产率。此外，酶连接法也能大幅度降低SPOS的试剂消耗，并减少生产成本。
（4）灵活的模块化合成特性。本案例采用的两步酶连接法验证了模块化合成的可行性。如有必要，可以对其他片段采用独立的酶连接步骤，从而确保特定片段的高纯度和高保真。该策略亦具备良好的扩展性，有望应用于更复杂RNA结构的合成，例如pegRNA（prime editing guide RNA，引物编辑向导RNA）。
在基因编辑技术从实验室向临床应用快速演进的今天，酶连接技术正成为突破长链sgRNA合成瓶颈的关键路径。通过分步式的合成，兆维科技的酶连接技术不仅大幅提升了sgRNA的纯度与产率，更能确保引导区的高保真。
兆维科技进一步提升酶连接技术，将其扩展至更长的sgRNA分子，如长度能达到250 nt的pegRNA。这类RNA在引导区的基础上融合了逆转录模板，对合成精度和结构完整性要求更高。我们相信双步酶连接法的高度灵活性会使其成为pegRNA工业化合成的最具潜力方案之一。随着未来CRISPR治疗方式的多样化，双步酶连接法将在基因编辑领域开启更广阔的应用空间！
2024年9月，兆维科技与美国CDMO服务提供商ReciBioPharm达成战略合作。兆维科技酶连法合成高纯度sgRNA技术将助力ReciBioPharm，为基因编辑药物开发带来更高质量的产品和更高效的解决方案！点击阅读原文，了解更多详情！
关于 兆维科技
上海兆维科技发展有限公司自1998年成立以来，一直深耕于核酸领域。目前，公司已经建立了小核酸药物CDMO和mRNA CDMO的全产业链平台，自主研发的酶法合成工艺技术已在全球率先实现公斤级规模的产业化生产。
公司拥有吨级以上的小核酸药物生产基地，提供临床前到商业化阶段的开发和生产服务；另有亚磷酰胺类产品线，年产能达58吨，以及全球105亿剂mRNA疫苗的原料需求。公司与世界各地的生物技术和制药公司建立了长期合作关系，为众多临床阶段和已商业化的核酸管线供应原料。欲了解更多关于兆维科技及其核酸产品的信息，请访问官网www.hongene.com 并关注我们的公众号“上海兆维 Hongene”。
