瑞芬太尼联合脐血间充质干细胞预处理对大鼠颅脑损伤后 神经功能修复的影响
颅脑损伤的发生率、死亡率和残疾率都较高。严重的脑损伤即使经治疗挽救了生命，但其所引发的运动、记忆及情感等后遗症却极大地影响患者的生活质量，给病人家庭与社会造成巨大的经济和精神负担。如今临床上多半情况下采用对症支持、减轻脑肿胀等治疗措施处置颅脑损伤。
脐血间充质干细胞( UC-MSCs) 与BM-MSCs 相对照，除生物学特性相似外，展示出进一步低沉的免疫原性， 且此类细胞在离体特殊待定的前提下可定向分化为 神经元样细胞。瑞芬太尼是一类效果很强的阿片类镇痛药，因它能被迅速分解，具备半衰期短、 药物耐受性好等特性，在 临 床 麻 醉 中 普 遍 使 用。研究表明，瑞芬太尼对大鼠全脑缺血再灌注( IＲ) 损伤有修护效果。本文观察瑞芬太尼 预处理结合UC-MSCs 对大鼠颅脑损伤后神经功能修护的作用。
1、动物及分组
健康成年雄性 SD 大鼠 60 只， 体重 180～230 g。动物自由喝水，所用饲 料切合标准，遵循日夜规律。适应性饲养 1 w 后。随机分成 IＲ 组，UC-MSCs 组，瑞芬太尼+UC-MSCs 组( 联合组) ，每组 20 只。IＲ 组在 IＲ 前 5 min 由尾 静脉打针注入 1 ml 生理盐水，UC-MSCs 组由尾静脉 打针注入 UC-MSCs 混悬液 1 ml，联合组除了由尾静 脉打针注入 UC-MSCs 混悬液 1 ml 之外在冠状动脉 阻断 前 10 min 经尾静脉打针注入瑞芬太尼 10 μg /kg。
2、主要材料及来源
主要仪器: 动物呼吸机( 北京众实迪创科技) ，恒温水浴锅，生物机能实验系统，电子天平，稳压稳流卵白电泳仪，隔水式培养箱，心肌切片仪，荧光定量PCＲ仪，琼脂糖水平电泳槽，扫描仪，公司低温离心机; 全自动真空脱水机、组织包埋机、石蜡切片机、展片机; 光学显微镜。
主要试剂: 瑞芬太尼，戊巴比妥钠、ＲT反转录试剂盒，试剂盒、琼脂糖，蛋白提取试剂盒及二喹啉甲酸( BCA) 蛋白测定试剂盒; 兔抗鼠胶质纤维酸性蛋白( GFAP) 多克隆抗体、兔抗鼠生长相关蛋白( GAP) -43 多克隆抗体，二抗显色试剂盒，L- DMEM 培养基、胰蛋白， 胎牛血清 ，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒。
1、大鼠颅脑损伤模型的建立 采取四动脉隔断法制作大鼠全脑IＲ损伤模型。
SD大鼠由腹腔打针注入10%水合氯醛(350mg/kg)麻醉后，俯卧位禁锢在手术台上，正常给皮毛消毒，在后脖颈中央1、2颈椎处刺一个长度约1.5cm豁口，剥开颈 部肌肉袒露第1颈椎双侧小孔，用灼烧的大头针烧灼双边椎动脉，使其永久锁闭，缝合伤口。1d 后同理麻醉动物，改为仰卧位，消毒表面皮肤，脖颈前中央切开豁口，拨开双侧颈总动脉并挂线，缝合伤口，正常饲养。1d后苏醒状况下，把大鼠放入鼠盒，进行尾静脉穿刺并留下静脉套管针。予肝素 ( 50 IU/kg) 抗凝，并联合微量泵预备注入生理盐水 和瑞芬太尼。30min预处置之后，颈前中心切口，拨开双边颈总动脉，用细小的动脉夹封锁，形成全脑缺血模型，15min后打开动脉夹，恢复血流缝合伤口。回笼常规喂养。
2、ＲT-PCＲ检测 Caspase-3 基因转录情况
将80～120mg和1mlTrizol试剂一起电动制备均匀浆液，再经氯仿、异丙醇、乙醇等有机试剂处置后，提取总ＲNA，在逆转录酶的催化下合成cDNA。
3、Western印迹检测GFAP及GAP-43蛋白表达水平
实验动物断头处死，在低温下迅速剥离海马组织并储存在液氮中; Tis-试剂抽提海马组织蛋白; BCA法蛋白定量; 10% SDS-PAGE 凝胶电泳，加样量为10μg，电泳完毕后，开始蛋白质转膜; 与GAP-43一抗、GFAP一抗杂交反应; 再将醋酸铅膜与辣根过氧化物酶记号的山 羊抗兔IgG杂交反应1h，在暗室进行X-光胶片曝光、显影和定影。然后用同一张醋酸铅膜与内参β-actin进行杂 交反应。
4、TUNEL法检测神经元凋亡数
①提前用多聚赖氨酸包裹玻片;
②切片正常脱白蜡;
③30% H2O2室温处理10 min，蒸馏水洗涤2min×3;
④37℃下加入蛋白酶K工作液，反应15～30min后，PBS漂洗5min×3;
⑤加标记缓冲液20μl/片，以保持切片湿润。按每张切片获得TDT和D-DIG-UTP每1μl加入18μl缓冲液拌匀。
⑥封闭液封闭、稀释、DAB 显色、蒸馏水冲洗、脱水、透明、封片，显微镜观察。
5、改良神经功能( mNSS) 评分法检测神经功能修复情况分别于移植术后第1、3、7、14、28天行神经功能缺损评分，主要从运动能力、感觉能力、平衡能力和异常活动方面进行评估，运动能力测试6分，感觉能力测试2 分，平衡能力测试6分，反射缺陷或异常活动4分，最高18分，最差0分，分数越高神经功能缺失情况越严重。
细胞凋亡是基因调控下细胞主动性死亡过程。全脑IＲ 后神经元损伤机制系种种元素彼此交错、彼此相关的错综复杂的反应体系。研究表明，细胞凋亡与脑I/Ｒ损伤有紧密关系。严重的长时间缺血会引发神经细胞坏死，轻度短时间缺血及再灌注会导致神经细胞发生凋零死亡。海马组织系与学习、记忆、行为和情绪压力紧密接触的一个重要领域，也系造成的组织基本结构损伤之一 的主要靶器官。目前已知有多种基因，如 Bcl-2、Bax、p53、Caspase-3、C-myc、Fas 等均与细胞凋 亡有关，Caspase-3属于半胱天冬氨酸蛋白酶的一种，处于凋亡过程的下游，系促进细胞凋亡过程的一个关键性蛋白酶。GFAP系存在于星形胶质细胞中的特异性糖蛋白和骨架组分之一，扮演着保护支撑神经细胞及参加代谢的角色，同时其表达的 高低在某种程度上反馈了神经元的损伤程度。当脊髓受到损伤后，各种细胞因子发挥作用，使得静 息状态的星形胶质细胞逐渐活化，GFAP 表达也随之上调。GAP-43 系评价估计神经元轴突毁伤和 重生反应的重要标识。本文显示，瑞芬太尼联合UC-MSCs能显著改善大鼠神经功能缺失状况，且通 过抑制Caspase-3基因表达水平及上调GFAP及GAP-43蛋白白表达水平减轻神经元凋亡，从而施展修护IＲ 损伤大脑的作用。
