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近几年来，越来越多专注于基因功能的研究取得了成功，同时，基因功能研究过程中所面临的诸多技术瓶颈也愈加凸显，以基因敲除/敲入等技术为中心的试验愈加不能满足功能研究与临床技术转化的需要。在过去一段时间中， 以ZFN和TALEN 技术为代表的序列特异性核酸酶技术以其能够高效率地进行定点基因组编辑， 在基础研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。然而，由于ZFN和TALEN 技术本身所存在的多种技术瓶颈，这两种技术并不能实现快速发展并满足各种科研和临床需求。令人振奋的是，最新问世的CRISPR/Cas9技术拥有其它基因编辑技术无可比拟的优势。通过不断的技术改进，CRISPR/Cas9技术被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。同时，基于CRISPR/Cas9技术相对较低的实验成本和高成功率，该技术有望应用于临床药物研究与基因治疗并已在目前的商业化和临床转化过程中取得了令人瞩目的成就。更加令人欣喜的是，在原有技术基础上，CRISPR/Cas9技术的平台化为该技术的不断改良与适应性拓展打下了坚实的基础，在此基础上，多家实验室对CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展做出了不同的贡献。本文将具体列举CRISPR/Cas9基因编辑技术近期取得的研究与应用进展。
1.CRISPR/Cas9基因编辑技术进展
1.1高脱靶率的改良
在CRISPR/Cas9基因编辑技术基础上，Jin-Soo Kim团队应用酶消化基因组测序绘制出几种CRISPR-Cas9核酸酶的全基因组特异性草图，能够快速且低成本地发现目的和非目的indel。利用不含细胞DNA的优势在于这种技术可以产出精确的分析结果。在这项研究中，研究人员利用多重酶消化基因组测序在体外鉴定出能被切割的靶位点和脱靶位点，找出了上百个能够潜在导致意料之外突变的脱靶位点，并在细胞内测量了这些脱靶位点的indel发生频率。[1]
同样基于这一问题的解决，Broad研究所和麻省理工学院McGovern脑研究所的研究人员设计了新的CRISPR-Cas9基因编辑系统，在构成化脓性链球菌Cas9酶的约1，400个氨基酸中，他们通过改变3个氨基酸将“脱靶编辑”显着减少至无法检测到的水平。研究人员将负电荷DNA结合到至Cas9蛋白正电凹槽中，减少了CRISPR-Cas9基因编辑系统的脱靶切割。在一系列的实验验证之后，研究小组发现特定氨基酸突变可大大减少“脱靶”切割。利用测试的导向RNAs，研究人员证实“脱靶”切割已降低至检测不到的水平。[2] Scot Wolfe等人则通过CRISPR/Cas9系统的额外校对步骤，通过将锌指DNA结合结构域融入到CRISPR/Cas9系统中，显著改善了CRISPR/Cas9系统的精确性，可以将编辑错靶和脱靶率下降至0.01。[3]美国德州理工的科学家则通过对sgRNA构象的优化在一定程度上提高了CRISPR/Cas9系统基因敲出的效率。[7]
美国哈佛大学研究人员对CRISPR/Cas9技术进行改进，构建出一种新的“碱基编辑器（base editor）”，在一定程度上避免了编辑过程中识别错靶等问题的发生。在人细胞系和小鼠细胞系中，这种碱基编辑器永久性地和高效地将碱基胞嘧啶（C）转化为碱基尿嘧啶（U），同时具有较低的编辑错误发生率。[4] Yasuda等人开发出一种新的方法，准确地修饰活组织样品中的神经元DNA。研究人员选择子宫内电穿孔技术，将CRISPR/Cas9系统插入到仍然在发育和分裂的胎儿期脑细胞中，导入一种能够在显微镜下可视化观察感兴趣蛋白的基因。他们甚至能够可靠地在同一个细胞中利用不同的颜色同时对两种不同的蛋白进行标记。他们利用多种成像方法和DNA测序证实目的序列是否真正敲入基因组。[11] CRISPR-Cpf1也能在crRNA的引导下在人类细胞中剪切目标DNA，被称为是新一代的CRISPR基因组编辑系统。Broad研究所和Wageningen大学的研究人员在CRISPR-Cpf1的基础上打造了一个多重化基因编辑系统。[23]本月12号，PNAS则报道了一篇加拿大学者通过人工酶修饰Cas9降低编辑系统脱靶率与拓展技术应用的研究。[24]
1.2利用CRISPR/Cas9系统进行RNA编辑
与上述几种降低编辑错靶技术系统所不同，NIH等机构的科学家对CRISPR系统提供了一种新颖的细胞操纵手段，将sgDNA靶向作用于RNA而不是DNA。尽管DNA编辑会让细胞基因组发生永久性变化，但是这种基于CRISPR的RNA靶向方法可能允许科学家们让细胞基因组发生可根据需要进行上下调节的临时变化，而且比现存的RNA干扰方法具有更大的特异性和功能性。[5]
与上述研究相似，来自土拉热弗朗西丝菌（Francisella novicida）的CRISPR结合蛋白Cpf1---的特征：Cpf1表现出双重切割活性：不仅切割DNA，而且也切割RNA。与CRISPR-Cas9不同的是，Cpf1能够独自地对crRNA前体（pre-crRNA，编者注：CRISPR DNA片段经转录而形成的CRISPR RNA前体）进行加工，然后利用加工后产生的crRNA特异性地靶向和切割DNA，因而也就不需要来自宿主细胞的核糖核酸酶（RNase）和tracrRNA，这是人们迄今为止发现的一种最简单的CRISPR免疫系统。[6]
2.CRISPR/Cas9基因编辑应用进展
2.1病毒性疾病的诊断与治疗
2.1.1整合HIV-DNA切除
美国天普大学的科学家首次报道了该系统对体外哺乳动物细胞中的整合HIV-DNA的切除，该机构的Khalili等人使用重组腺相关病毒（rAAV）载体运送系统。他们也对这种基因编辑系统进行基因改造以便能够切割整合到宿主细胞基因组中的HIV-1 DNA，从而导致病毒DNA片段从宿主基因组中切除。[8]在原有研究的基础上，该团队进一步实现了CRISPR/Cas9基因编辑系统对成熟人免疫细胞中整合HIV-DNA的切除。[9]
2.1.2对其他病毒性疾病的诊断与预防
James Collins等人开发出一种低成本的基于试纸的快速诊断系统，该系统能够毒株特异性地检测寨卡病毒（Zika virus, ZIKV），而且它可能很快被用来在现场筛查血液、尿液或唾液样品。这种诊断系统的第三部分就是CRISPR-Cas9辅助的基于纸片的诊断模块以便区别不同的遗传特征序列最少只相差一个核苷酸的毒株。[10]
2.2细胞与动物模型的构建
Dominik Paquet等人利用CRISPR-Cas9技术在细胞中插入两种遗传突变，而这两种遗传突变和引发阿尔兹海默氏症疾病的β淀粉样蛋白的产生直接相关，研究人员通过这种方法构建了老年痴呆细胞模型。[12] Eric N. Olson等人则通过CRISPR-Cas9技术组构建了在心肌细胞中特异性表达Cas9的小鼠，之后利用腺病毒介导的针对Myh6基因的sgRNA的感染，成功得到了心肌细胞特异性Myh6基因敲除的小鼠。[13]
MIT的研究人员则通过CRISPR/Cas9技术系统设计了一种在人细胞DNA组中记录复杂的历史事件的方法，他们可以通过对这种DNA进行测序从中找回过去事件的“记忆”。[14]
美国杜克大学研究人员他们利用经过基因修饰的CRISPR/Cas9基因编辑技术直接激活已经存在于细胞基因组中的自然拷贝，激活细胞中特定的蛋白网络实现了成熟细胞的去分化。[15]
相比之下更加激进的研究集中于猪移植器官PERV的清除，研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在一定程度上对动物移植器官的安全性进行了保障。[16,17]
2.3CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于疾病治疗的探索
杜克大学的研究人员通过AAV运输基因编辑系统，成功克服了当前该领域的多种技术障碍。小鼠模型机体的肌营养不良蛋白基因的一个外显子出现了一定的突变，研究者就对新型的CRISPR/Cas9系统重编程来切断这种异常的外显子，使得小鼠机体自然的修复系统可以对存留的基因进行修正从而产生缩短但功能正常的外显子基因。[18]
第58届美国血液学会年会和博览会上，来自宾夕法尼亚大学的研究人员通过研究首次开发出了一种双基因疗法，其能够将CRISPR/Cas9介导的基因靶向系统的关键组分运输到小鼠机体中来治疗B型血友病（Hemophilia B），这是一种第九因子缺乏症，该疾病通常是由于凝血蛋白缺失或缺陷引发。[19]
德国的Frank Buchholz等人则通过CRISPR/Cas9介导的基因靶向系统对癌症中的特定突变进行切除与编辑，在某种程度上为新型癌症治疗技术的开发提供了新的见解。[20] 中国科学院王皓毅等人利用CRISPR-Cas9技术在CART细胞中实现多基因编辑，研究发现通过基因编辑的CART细胞同普通CART细胞相比，在体外及体内具有相当或更强的肿瘤细胞杀伤功能，有望成为临床应用的效应细胞。
2.4临床治疗的基因编辑
中国成都市四川大学华西医院的一个研究人员团队首次将利用CRISPR-Cas9进行过基因编辑的细胞注射到一名病人体内，该团队从血液样品中分离出免疫细胞，然后利用CRISPR-Cas9寻找它们中的PD-1蛋白，并且让该蛋白不能发挥功能，而之前的研究已证实这会延缓免疫细胞作出的免疫反应。[21]
参考文献：
[1] Kim D, Kim S, Kim S, et al. Genome-wide target specificities of CRISPR-Cas9 nucleases revealed by multiplex Digenome-seq.[J]. Genome Research, 2016, 26（3）
[2] Slaymaker I M, Gao L, Zetsche B, et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity[J]. Science, 2016, 351（6268）：págs. 84-88.
[3] Fatih B M, Ankit G, Sarah O, et al. DNA-binding domain fusions enhance the targeting range and precision of Cas9:[J]. Nature Methods, 2015, 12（12）：1150-1156.
[4] Komor A C, Kim Y B, Packer M S, et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage[J]. Nature, 2016, 533（7603）：págs. 420-424.
[5] Abudayyeh O O, Gootenberg J S, Konermann S, et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.[J]. Science, 2016, 353（6299）。
[6] Fonfara I, Richter H, Bratovi? M, et al. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA[J]. Nature, 2016, 532（7600）：págs. 517-521.
[7] Ying D, Jia G, Choi J, et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency[J]. Genome Biology, 2015, 16（1）：1-10.
[8] Kaminski R, Bella R, Yin C, et al. Excision of HIV-1 DNA by gene editing: a proof-of-concept in vivo study.[J]. Gene Therapy, 2016, 23（8-9）。
[9] Kaminski R, Chen Y, Fischer T, et al. Elimination of HIV-1 Genomes from Human T-lymphoid Cells by CRISPR/Cas9 Gene Editing[J]. Scientific Reports, 2016, 6.
[10] Pardee K, Green A A, Takahashi M K, et al. Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.[J]. Cell, 2016, 165（5）：1255-1266.
[11] Mikuni T, Nishiyama J, Sun Y, et al. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing.[J]. Cell, 2016, 165（7）：1803-1817.
[12] Paquet D, Kwart D, Chen A, et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.[J]. Nature, 2016, 533（7601）：págs. 125-129.
[13] Carroll K J, Makarewich C A, Mcanally J, et al. A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9.[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113（2）。
[14] Perli S D, Cui C H, Lu T K. Continuous genetic recording with self-targeting CRISPR-Cas in human cells.[J]. Science, 2016, 353（6304）.
[15] Black J B, Adler A F, Wang H G, et al. Targeted Epigenetic Remodeling of Endogenous Loci by CRISPR/Cas9-Based Transcriptional Activators Directly Converts Fibroblasts to Neuronal Cells.[J]. Cell Stem Cell, 2016, 19（3）：406-414.
[16] Yang L, Güell M, Niu D, et al. Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses （PERVs）。[J]. Science, 2015, 350（6264）。
[17] Salomon D R. A CRISPR Way to Block PERVs--Engineering Organs for Transplantation.[J]. New England Journal of Medicine, 2016, 374（11）：1089-1091.
[18] Nelson C E, Hakim C H, Ousterout D G, et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy[J]. Science, 2015, 226（3026）：44-45.
[19] medicalxpress.com/news/2016-11-scientists-crispr-clotting-newborn-adult.html
[20] Gebler C, Lohoff T, Paszkowskirogacz M, et al. Inactivation of Cancer Mutations Utilizing CRISPR/Cas9[J]. Journal of the National Cancer Institute, 2017, 109（1）.
[21] Cyranoski D. CRISPR gene-editing tested in a person for the first time.[J]. Nature, 2016, 539（7630）.
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