独家整理：细胞王国
作者：张娟、史晋叔、李剑
源自：中国实验血液学杂志
间充质干细胞源性外泌体(MSC-exosomes)是间充质干细胞在生理或者病理状态下分泌的直径在40-100nm的同质性膜囊泡。MSC-exosomes含有大量且种类繁多的蛋白质和miRNA等生物活性物质。MSC-exosomes与靶细胞通过膜融合或者发生内吞作用后将其中的生物活性物质转运至靶细胞，从而影响靶细胞的功能。 它们像是体内的信号载体储存池，在细胞间起信息交换的作用。MSC-exosomes能够模拟MSC的生物学功能，具有促进组织修复或调节免疫等作用。
用基因命运图谱技术显示再生的细胞来自于模型中存活的固有细胞。 这些信息提示MSC对组织的修复作用可能不是由于其分化能力。紧接着有研究者发现MSC的条件培养基(CM)能模拟MSC修复组织的功能。因此推测MSC可能是通过分泌营养因子以内分泌和旁分泌的方式促进组织修复。直至2010年Lai等分离了这些起修复作用的营养因子，首次证实为间充质干细胞外泌体(MSC-exosomes)。
至今为止，MSC被认为是产生外泌体能力最强的细胞。MSC-exosomes是MSC在生理或者病理状态下分泌的直径在40-100nm的同质性囊泡，由与细胞质膜相同的脂质双分子层包裹，内部含有蛋白质和RNA等生物活性物质。它们像是信号储存池，通过交换蛋白质和基因信息的方式，促进细胞间信息沟通。近几年来一些研究发现MSC-exosomes能模拟MSC的生物学功能，也逐渐被证实能促进组织修复和治疗一些不可治愈的疾病，具有广阔的应用前景。
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MSC-exosomes的生物学特性
➤ MSC-exosomes的产生和释放
MSC-exosomes的产生机制与其他细胞来源的外泌体产生机制一致，都是通过胞内体途径。初级核内体形成后，其界膜向内出芽，吞没一部分胞质成分伴跨膜蛋白及膜周蛋白内陷，形成含有一些囊泡的次级核内体，也叫做多泡体。这个过程依赖于转运必需内体分选复合物(EscRT)的作用，EscRT系统包括ESCRT-0、ESCRT-1、ESCRT-II、ESCRT-III共4个蛋白复合物。这4个复合物相继发生作用，最后召集并与衔接蛋白Alix连接，促进囊泡出芽。膜上的同线蛋白和蛋白多糖也发挥重要作用，Alix与同线蛋白结合，而蛋白多糖与CD63结合。用基因沉默技术分别抑制ESCRT、同线蛋白、蛋白多糖及Alix，都能导致外泌体分泌减少。多泡体在形成过程中可以分选包裹不同蛋白，而多泡体形成后有两种命运。它既可以与溶酶体结合，将内容物降解，也可以与质膜结合，将囊泡以外泌体的形式释放到内环境中。目前，对于选择将内容物向外分泌的多泡体的蛋白分选机制还不清楚。除了ESCRT依赖途径，有学者提出外泌体的产生也依赖4次跨膜蛋白和神经酰胺，认为MSC-exosomes来自于MSC质膜中产生内吞作用的脂筏区。外泌体的释放主要由Rab家族蛋白调节，其中Rab27a和Rab27b是主要的调节子；其次，Rab35和Rabll通过与10A-C结合也能调节其分泌。
➤ MSC-exosomes物质成分
MSC-exosomes的悬浮密度为1.10-1.18g／ml。MSC-exosomes膜表面富含胆固醇、鞘磷脂和神经酰胺脂筏脂质及信号蛋白，内部含有大量且种类繁多的蛋白质和RNA。这些生物活性物质的种类和数量并不是始终相同，而是随着MSC生理状态的变化而改变。
MSC-exosomes包含所有外泌体共同表达的物质，包括转膜蛋白和融合蛋白(GtP酶、膜联蛋白、浮舰蛋白)，4次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)，多泡体生成相关的蛋白(Alix、TsGl01)、脂质相关蛋白和磷脂酶。MSC-exosomes也含有MSC表达的粘附分子，包括CD29、CD44和CD73等。目前发现，MSC-exosomes一共含有857种蛋白质，但并非全部蛋白都同时表达。在3组独立实验中， 通过质谱分析法，测得MSC-exosomes分别含有379，432，420种蛋白质，其中只有154种蛋白质共同表达。这857种独特的基因产物，充分代表32种生物过程，包括外泌体生成和免疫等。在这些蛋白质中，与治疗作用相关的可能包括表面受体(PDGFRB，EGFR，PLAUR)、信号分子(RRAS／NRAS，MAPKl， GNAl3／CNGl2，CDc42和VAV2)、粘附分子(FNl，EZR，IQGAPl，CD47，整合素，LGALSl／LGALS3)和 MSC相关抗原等。值得一提的是，MSC．exosomes 都表达蛋白酶体20S核心颗粒的7条α和7条β链，同时免疫蛋白酶体中的3个亚基表达水平较高。因此，MSC-exosomes能够适当而有意义的减少损伤组织的蛋白质聚集，这可能与其组织修复功能密切相关。
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MSC-exosomes的生物学功能
➤ 保护肾脏损伤
MSC-exosomes能够保护药物、肾切除等诱导的肾损伤。在5／6肾切除模型，MSC-exosomes治疗组减轻残余肾纤维化和淋巴细胞浸润程度，肾小管萎缩减少甚至缺失，其组织学评分与MSC治疗组相近，几乎保持了肾的正常形态。这个研究提示我们，MSC-exosomes能够模拟MSC对肾脏的修复功能。在顺铂损伤的肾脏，MSC-exosomes在体内外都能够缓解损伤肾的氧化应激状态，减少细胞凋亡和促进细胞增殖，从而减轻顺铂对肾脏的损害。在庆大霉素损伤的肾脏，注射MSC-exosomes后能引起相同的保护效应。如果提前将MSC-exosomes与胰蛋白酶共同培养，其保护功能稍微降低，而提前与RNase共同培养，那么该保护作用则完全消失。因此MSC-exosomes对肾脏的保护作用可能是通过其巾包裹的某些RNA来实现的。
➤ 减轻心肌缺血／再灌注(L/R)损伤
MSC-exosomes能够减轻心肌缺血／再灌注(L/R)损 伤。在L/R模型，再灌注前5min静脉注入MSC-exosomes可以使梗死面积减少45％，其减少程度与注入的量呈正相关。该保护效应由Msc-exosomes与心肌细胞直接相互作用所获得，并且需MSC-exosomes保持完整性。不仅如此，MSC-exosomes对L/R心脏具有后续保护作用。在瘢痕成熟过程中，Msc-exosomes能够降低梗死部位厚度变薄程度。MSC-exosomes不间断治疗至28d，左心室的功能和结构可恢复至与基准线值没有差别，舒张末期容积和收缩末期容积也在正常值范围内。左室的收缩能力、舒张能力和射血分数比阴性对照组显著提高。因此，MSC-exosomes不仅能够减少心肌梗死面积，也能够长期保护心脏功能和减少心脏不良重塑。对比MSC-exosomes和L/R心肌的蛋白质发现，MSC-exosomes的治疗机制可能是通过蛋白互补实现的。MSC-exosomes将糖酵解酶和具有抗氧化作用的还原酶及谷胱甘肽硫转移酶转运给L/R心肌，使心肌细胞产生更多的ATP和减少氧化应激，从而减少细胞的死亡数量。同时MSC-exosomes表达的CD73将AMP水解为腺苷，腺苷与其受体结合后激活ATK和ERKl/2等再灌注损伤补救激酶(RISC)信号通路，这些激酶通过诱导生存信号和包围促凋亡蛋白的方式减少细胞凋亡。
➤ 保护内毒素诱导的肺损伤
MSC-exosomes能够保护内毒素诱导的肺损伤。在该模型中，气管滴注MSC-exosomes 48h后，肺水肿程度和蛋白质渗透率都比阴性对照组显著降低，MSC-exosomes治疗组肺血管外水含量减少了43％，支气管灌洗液中的总蛋白也减少了35％。同时炎症程度也明显减轻，中性粒细胞和巨噬细胞免疫蛋白2水平分别分别减少了73％和49％。如果将MSC提前与干扰角化细胞生长因子(KGF)的siRNA 共培养后，MSC-exosomes的保护作用被部分消除。因此，推测MSC-exosomes对损伤肺的保护作用机制，一部分来由于它将KGF的mRNA转运至肺组 织，而KGF具有促进II型肺泡上皮增生和抗凋亡等生物学功能。
➤治疗脑中风和阿尔茨海默病的潜能
MSC-exosomes能够保护脑中风。在大脑中动脉闭塞(MCAo)模型，MSC-exosome治疗组和阴性对照组的缺血梗死面积无差别，都包括感觉运动皮质前肢区、纹状体和视上区。但是MSC-exosome治疗两周后，通过脚误测试结果显示其功能显著提高及改良神经功能评分(mNSS)也增加。MSC-exosome治疗4周后，缺血边界区(IBZ)周围的神经轴突数量显著增多，并且能够检测到神经再生信号和血管再生信号。MSC-exosomes还能够增加神经突分支数量和神经突的总长度。这些保护和促生长机制源于MSC-exosomes中的miR-133b。MSC与缺血组织共培养后，MSC和MSC-exosomes中的miR-133b含量都明显增多，其后MSC-exosomes够将其中的miR-133b转运至神经组织以产生保护作用。除此之外，MSC-exosomes还被证明具有治疗阿尔茨海默病的潜能。这是因为MSC-exosomes含有脑啡肽酶 (NEP-一种脑中降解导致阿尔茨海默病的B淀粉样蛋白质最重要的酶)，并且其活性较高，1ug MSC-exosomes蛋白中的NEP功能相当于0.3ng重组人NEP。MSC-exosomes进人神经细胞后，细胞中新合成的β淀粉样蛋白质量及其总量都减少。
➤调节免疫系统功能
MSC-exosomes对免疫系统有重要的调节功能。MSC-exosomes能够诱导单核细胞分泌TH2和TGF-β抗炎因子，抑制淋巴细胞增殖，其作用能力与MSC的激活状态呈正相关。不仅如此，MSC-exosomes还能诱导激活的T细胞凋亡，增加调节性T细胞的比例。MSC-exosomes与单核细胞共培养后，Foxp3+细胞比率和CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例都升高。这些都说明MSC-exosomes能够抑制免疫反应。除此之外，MSC-exosomes能够调节外周自身免疫耐受，可用于治疗自身免疫性疾病。MSC-exosomes表达程序性死亡配体1(PD-L1)、乳糖凝集素(galectin-1)和β转化生长因子(TGF-β），这些物质能够有效地抑制自身免疫细胞，从而阻止这些细胞导致的组织损伤。科研人员发现MSC-exosomes能够激活单核细胞MYD-88依赖的信号，诱导产生 M2表型的单核细胞，然后极化激活CD4+T细胞形成调节性T细胞。该反应链最终使移植物抗宿主病延迟出现。不仅如此，MSC-exosomes还能够抑制补体激活，该作用得益于MSC-exosomes表达的具有抑制膜攻击复合物(MAC)形成的CD59。
间充质干细胞是目前研究最多的干细胞，截止2010年就有101个临床试验应用MSC治疗各种疾病，其治疗效果引人注目。以往认为这些治疗潜能是由于MSC归巢、分化并替代损伤细胞，但近几年逐渐发现其治疗机制与MSC-exosomes有关。虽然对于MSC-exosomes的研究还不是很多，但它已经表现出强有力的治疗潜能。MSC-exosomes能够模拟MSC的生物学功能，靶细胞以膜融合或者内吞作用获取 MSC-exosomes中的生物活性物质后，具有促进组织修复或调节免疫反应等作用。与MSC相比，MSC-exosomes更具有优势。因此，MSC-exosomes有代替MSC的趋势，从依赖MSC的细胞替代疗法向依赖MSC-exosomes的生物疗法转变。
总结：间充质干细胞外泌体优势
外泌体是细胞分泌的小生物膜囊泡。与间充质干细胞相比，其所分泌的外泌体体积更小、复杂性更低，易于生产和存储，甚至更容易避免间充质干细胞面临的一些监管问题。
间充质干细胞外泌体没有细胞的活性，并且不构成形成肿瘤的风险。此外，由于膜结合蛋白含量较低，外泌体的免疫原性低于间充质干细胞。
间充质干细胞外泌体对维持细胞内稳态以及对外界刺激作出反应起到了重要的作用。当组织微环境稳态因疾病或损伤而遭到破坏时，这种作用就显得更加重要了。
间充质干细胞外泌体富含生物活性分子，如蛋白质和RNA。存在于外泌体中的许多蛋白质都属于酶类，具有催化活性，并且这些活性与所处的环境有关，如底物浓度和pH。因而，若用于治疗，外泌体中的酶也许可以缓解药物剂量不足或过量的问题。
外泌体是一种理想的传递载体。通过将分子包裹在膜内，外泌体可以保护酶或者RNA免于降解，并通过细胞内吞作用来促进细胞内摄取。此外，外泌体是一种纳米大小的颗粒，易于在血液以及其他体液中转移。
版权声明：文中“间充质干细胞外泌体优势”部分总结，源自微信公众号：博雅干细胞，感谢他们的分享。
