荧光定量western blots多重检测：十大必知，不走弯路

荧光定量western blots是进行蛋白质定量的金标方法，也是对蛋白质进行多重检测最理想的方法，能够实现泳道内（in-lane）检测内参蛋白和靶标蛋白，并执行归一化，完美质控蛋白样品上样量，使得翻译后修饰蛋白的研究和定量检测明朗了许多。

在荧光western blots中，二抗偶联了荧光基团，经入射光激发后产生特定波长的发射光，检测器捕获发射光从而成像，通过软件即可对图像进行数据分析。二抗偶联不同的染料，激发后产生不同波长的发射光，实现同时检测多重蛋白。

荧光western blots整个操作与化学发光类似，为造福小伙伴们，不必重踏小编的血泪弯路，小编分享10大心得：

1.滴定法确定一抗和二抗使用浓度：使用点杂交和棋盘滴定法确定一抗和二抗最佳浓度。

2.通常一抗使用浓度2-5倍于传统的化学发光；二抗的使用浓度也需要提高，建议初始稀释度为1:5000。

3.多重检测时，需要：

> 先分别对每种靶标蛋白和内参蛋白进行检测优化；

> 确保一抗物种来源不同，使用血清预处理过的二抗（cross adsorded二抗），避免交叉识别；

> 荧光染料要避免重叠，选择发射波长距离远的染料；

4.使用低自发荧光的PVDF膜：NC膜和部分PVDF的自发荧光会到导致高背景，降低灵敏度。

5.使用荧光分子量Marker时，请跳过一个泳道再进行样品上样，可以避免Marker扩散到样品泳道。

6.不要使用产生荧光的标记和染料：使用铅笔标记印迹膜，避免使用有自发荧光的溴酚蓝和考马斯亮蓝染料。

7.所有物品保持洁净，确保背景无干扰：

> 成像前请彻底清洁整个设备及托盘；

> 佩戴无粉手套处理凝胶和印迹膜；

> 孵育时请遮盖托盘；

8.荧光标记的抗体必须避光保存中，防止发生淬灭现象。

9.为了增加特异信号，在蓝光通道检测强信号，在绿光通道检测中等信号，在红光通道检测弱信号。

10.印迹膜归档保存需严格避光。