一步法Crystal RT-数字PCR（Crystal RT-dPCR）直接进行RNA绝对定量检测

一步法反转录-PCR（RT-PCR）广泛用于RNA分析，如基因组表达、病毒检测，从生命科学研究到诊断的许多领域，都有所应用。一步法Crystal RT-数字PCR实现了直接对RNA样本进行多重靶标基因的检测（内参基因、多重目标基因）和病毒RNA的绝对定量，无需标准曲线，同时实现了基因表达的细微差异的精确检测。

一步法Crystal RT-数字PCR技术（Crystal RT-dPCR）实现了同一个反应中，通过三个荧光通道进行三种不同的mRNA分析，可以显著且准确地区分1.5倍的基因表达差异（图1）。

图1：一步法Crystal RT-数字PCR（Crystal RT-dPCR）对人总RNA中mRNAs进行绝对定量

对人总RNA进行1.5倍倍比稀释，浓度变化范围0.06ng/µl-3.6ng/µl，通过一步法Crystal RT-数字PCR对GUSB、ALB和TSN的三种mRNA进行三重绝对定量检测。使用1x qscript XLT One-step RT PCR Toughmix® 和FAM-、HEX和Cy5-标记的三种TaqMan^TM 探针。重复三次的实验结果显示每个靶标基因均具有良好的线性，准确性和再现性。GUSB = 588. 8 cp / ng：ALB = 96.5 cp / ng：TSN = 980.6 cp / ng

对于背景高的总RNA中低丰度转录子的检测极具挑战，使用Crystal数字PCR技术在检测低比例的转录子定量检测具有出色的线性和重复性（图2A）。即使在高浓度总RNA背景的情况下荧光强度一致，反应效率不受影响（2μg-图2B）。

图2：一步法Crystal RT-数字PCR绝对定量检测高浓度总RNA中的mRNA

对人总RNA进行2倍倍比稀释，浓度变化范围从2 µg 到125 ng，通过一步法Crystal RT-数字PCR对ALB的mRNA进行绝对定量。使用1x qscript XLT One-step RT PCR Toughmix®和HEX-标记的TaqMan^TM 探针。

线性图显示重复三次实验结果的准确性和重复性（A），并且在微滴荧光散点图中未观察到荧光的变化（B）。 RFU：相对荧光单位。 *每次反应27μL。

登革热1型病毒DEN-1和其他三种相近的血清型可以产生致命风险，如登革热出血热、登革热休克综合征。一步法Crystal RT-数字PCR，可以实现2.5个小时内，在无需标准品和标准曲线的情况下，对登革热病毒载量进行绝对定量检测，快速，友好且适用于所有实验室和工作流程。

图3：一步法Crystal RT-数字PCR绝对定量DEN-1病毒载量

将DEN-1病毒RNA（制造商通过数字PCR定量的标准品）中掺入300cp人总RNA作为背景，以ABL mRNA作为内参。使用1x qscript XLT One-step RT PCR Toughmix®，FAM探针检测DEN-1病毒，HEX探针检测ABL基因。线性拟合程度达0.99，重复性好。