复杂生物样本（含PCR抑制剂）中DNA/RNA绝对定量的解决方案： Crystal dPCR更耐受抑制剂

dPCR和qPCR(Real-time PCR)技术定量检测DNA/RNA时抑制剂的影响对比

众所周知，数以千种的化学物质会抑制PCR反应有作用，而生物样本往往都会含有类似的化合物，在DNA/RNA纯化时，这类化合物很难去除，所以会存在DNA/RNA样本中。

> qPCR和Crystal dPCR进行DNA/RNA定量的比较

qPCR (Real-time PCR)进行DNA/RNA定量时，基于Ct值，且依赖于分析的样品和标准品之间的标准曲线，通过未知样品与含有已知量核酸标准品之间的Ct值得到未知样品的浓度。但当样品中存在抑制剂时，标准品和样品之间由于背景不同，所以PCR反应效率可能不同，因此定量结果将会有偏差（图1A）。

Naica crystal dPCR进行DNA/RNA定量时，结果判读在于通过荧光值区分微滴的阳性或阴性。即使有因抑制剂存在而导致PCR反应效率降低，仍然可以实现准确定量（图1B）。

图1.腐殖酸在qPCR（A）和Crystal dPCR（B）系统分析中的影响比较

在qPCR和Crystal dPCR平台检测中PCR反应均包含1X PerfeCta Multiplex qPCR Tough-mix，100 nM荧光素，500 nM ALB基因正向和反向引物，250 nM Cy5标记TaqMan探针和5.4 ng / uL人类基因组DNA。分别掺入0, 50和100ug / mL的腐殖酸。

还有很重要的一点我们需要注意，抑制剂对于同一DNA/RNA样品中不同靶标基因绝对定量的影响也可能不同（图2）。Naica Crystal dPCR系统有3个荧光通道，检测您感兴趣的基因上不同区域或基因组上不同的靶标基因，以检查这种偏差。

图2.腐殖酸的存在对于Crystal dPCR中对不同靶标的影响检测

多重Crystal dPCR反应中含有PerfeCta Multiplex qPCR Toughmix，ALB基因的引物和探针（Cy-5标记），EGFR基因的引物和探针（HEX标记）和BRAF的引物和探针（FAM标记），并且使用相同量的人类基因组DNA掺入不同浓度的腐殖酸（利用Sigmoid即S型函数拟合）。以不添加抑制剂的DNA定量为0％抑制，计算抑制百分比。

> qPCR和Crystal dPCR对抑制剂的耐受性比较

我们在qPCR和Crystal dPCR平台比较了存在两种在样品中发现的已知抑制剂对DNA定量分析的影响，分别是在土壤样本中存在的腐殖酸和在收集的血样中用作抗凝血剂的肝素。结果显示，与qPCR相比，Crystal dPCR在任何较高浓度抑制剂存在的情况下，仍然可以进行准确定量（图3）。

图3. 不同浓度的腐殖酸（A）和肝素（B）对qPCR和Crystal dPCR的抑制。

qPCR和Crystal dPCR反应包含PerfeCta Multiplex qPCR Toughmix，相同量的人类基因组DNA，以及测试腐殖酸抑制作用的靶向BRAF基因和测试肝素抑制作用的EGRF基因的引物和探针。所有样品进行2次实验，每次实验三个重复（利用Sigmoid即S型函数拟合）。以不添加抑制剂的DNA定量为0％抑制，计算抑制百分比。

综上所述，当对存在抑制剂的样品进行DNA/RNA分析时，Crystal dPCR可以比qPCR的结果更为可靠。Crystal dPCR是您一直在寻找的针对含抑制剂样本中核酸检测和定量的最佳解决方案。

Naica Crystal微滴数字PCR，以Sapphire芯片为唯一耗材，形成25,000---30,000个微滴的2D阵列，以单层平铺方式进行PCR扩增实验。   

反应完成后对微滴进行三通道成像，从而得到精准的核酸绝对数量。两个半小时之内，可快速获得结果。

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