近红外精准定量western blot是近些年来炙手可热的技术，促进了医学、动物学、植物学等领域的发展。近红外western blot检测方法克服了传统化学发光检测方法的局限性，使用不同的荧光基团标记不同的二抗，即可进行不同蛋白的多重检测，特别是共迁移条带的检测（磷酸化蛋白）。NIR荧光检测不仅实现了快速的多重检测，同时实现了精准定量。现在也是收录期刊推荐使用的进行western blot检测的方法。
那么近红外western实验如何进行操作、有哪些需要注意的步骤吗，跟着小编一起来看看
近红外western于传统的化学发光实验步骤有什么区别吗？
近红外实验因为二抗是荧光基团标记的，所以不需要加入底物，洗完膜直接可进行成像、但仪器要有近红外光源进行激发染料。例如：Azure500近红外成像系统、AzureC600多功能成像系统带有660nm和785nm的双激光光源，可进行近红外染料的激发。
近红外western实验有哪些注意事项？
1.上样：marker如果在洗膜时不能洗掉,近红外western实验中，marker需要稀释1：30-50倍之后，按照正常的上样量进行上样。如果marker条带过于明亮会影响弱蛋白信号。
2.电泳：溴酚蓝指示剂要跑出胶板或者在转膜的时候将溴酚蓝切除后在进行转膜
3.转膜：近红外western实验最好使用低荧光的PVDF膜、降低背景信号的干扰、提高信噪比
4.封闭：最好使用适用于荧光实验的封闭buffer。例如：Azure Fluorescent Blot Blocking Buffer。如使用自己的封闭体系脱脂牛奶或BSA，需要进行优化。
5.抗体杂交：建议先做单色、单色优化好在进行双色的实验、一抗使用能做出来化学发光条带的稀释比例即可，近红外二抗孵育要避光操作。
6.漂洗：最好使用荧光漂洗buffer（Azure Fluorescent Blot Washing Buffer）。 2次快洗、3次慢洗（每次5min）荧光漂洗也需要避光操作。
7.成像：印记膜要全程用镊子进行夹取，不要污染，否则会有背景荧光。
近红外western最后没有检测出结果，原因有哪些?
1.样品提取的不好，表达丰度太低
2.Marker上样量太多，过于明亮，影响弱蛋白的信号的采集
3.一抗的特异性差
4.未经过优化的抗体
5.如果使用近红外试剂盒、可能没有严格按照试剂盒的操作进行试验
近红外western与化学发光成本如何？
如果我们有了近红外仪器，除了能做近红外精准western实验外，还有其他的应用吗？
> EMSA（凝胶迁移或电泳迁移率检测）实验
> in-cell western检测实验
> 活体成像
> 组织切片成像
>微印迹分析(micro-western arrays)
> 抗体阵列
等等
双激光近红外NIR成像：IR700、IR800等
三色RGB成像：CY5/CY3/CY2等
UV激发的成像：EB、GelView、GelGreen、GelRed等
蓝光成像：SybrGreen、SybrSafe、SybrGold等
白光成像：考马斯亮蓝，银染等
（以上部分内容来自微信号“深蓝云生物科技”）
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