Azure Sapphire双模式多光谱激光成像系统|四色荧光检测，效率更高效

Western印迹多重检测——同时在一个印迹膜上孵育多个探针——正在快速发展。化学发光测定允许检测单个蛋白，经过重孵育或者剥离实现检测多个蛋白，具有蛋白潜在损失和相应的信号的损失。早期Western印迹多重成像系统允许在单个印迹上同时检测两个荧光信号。研究人员迅速使用这种技术进行上样质控和目的蛋白的检测。

我们通过Azure Biosystems c600数字成像仪提供的荧光和近红外（NIR）成像功能，同时对三种蛋白质进行成像，提出了对双通道方法的改进。

在本说明中，我们将讨论进一步的改进 - 使用Azure Sapphire™双模式多光谱激光成像系统。能够同时检测四个蛋白，大大提高了Western blot的效率。通过四色蛋白质印迹可以实现使用四个光谱不同的荧光团和sapphire激光激发和敏感的光电倍增管（PMT）和雪崩光电二极管（APD）检测系统进行检测。

材料和方法

跑凝胶

不同的转铁蛋白，使用4-15%的Tris-Glycine凝胶电泳。电泳结束后，使用低荧光PVDF膜进行转印。

4色荧光western blotting

转印后，印记膜封闭30分钟使用Azure荧光印封闭液稀释 ratanti-tubulin（绿）， rabbit anti-beta-actin（红）和chicken anti-GAPDH（灰）一抗和anti-transferrin（蓝）以前已经被AzureSpectra 490染料标记使用AzureSpectra标记试剂盒。

将印迹膜使用Azure荧光印记漂洗buffer进行漂洗，然后使用goat anti-rat 550（绿），goat anti-rabbit 700（红），goat anti-chicken 800（灰）。 孵育后，印迹像以前一样在Azure 荧光漂洗buffer中进行漂洗，然后在PBS中最后冲洗一遍。

4色荧光成像

漂洗完成之后，成像之前将印记膜晾干，使用Azure Sapphire双模式多光谱激光成像系统进行成像。

结果和讨论

在本文中，同时检测了四种蛋白质在一张印记膜中。 tublin（绿），beta-actin（红）和GAPDH（灰色）抗体， 以及先前与AzureSpectra 490染料标记的转铁蛋白（蓝色）抗体进行直接分析。

Western blot使用Azure Sapphire双模式多光谱激光成像系统进行成像、图1展示的灰色图像转铁蛋白（a），tublin（b），beta-actin (c) 和 GAPDH (d)，整合图（e）。具有更高的灵敏度，特异性，更高的信噪比，允许快速准确进行精准定量。

在一张印记膜上同时成像四种蛋白质大大增加了Western印迹的效率，节省了时间和珍贵的样品，并且可进行精准定量。 该方法还允许使用新的测定法，例如蛋白相互的研究：磷酸化蛋白质测定。