美国国立卫生研究院（NIH）实验医学部门对五种商业化支原体检测试剂盒*进行比较测试。研究结果表明，结合EP和JP对替代方法灵敏度要求，并非所有的支原体检测试剂盒或支原体检测平台都能替代培养法成为支原体污染检测方法。
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* 五种商业化支原体检测试剂盒：
• MycoSEQ支原体检测试剂盒（赛默飞，美国）
• VenorGEM支原体检测试剂盒（MB，德国）
• MycoTool支原体检测试剂盒（罗氏，瑞士）
• ATCC支原体检测试剂盒（ATCC，美国）
• Biofire支原体检测系统（生物梅里埃，法国）
由于在细胞培养中发生支原体污染的风险很高，FDA规定细胞治疗产品上市前必须进行支原体污染检测，以确保该产品的无菌性和安全性。
USP、EP、JP中规定的传统检测方法（培养法和指示细胞培养法）可作为支原体污染检测标准方法，但培养法周期长至28天，样品需求量多至15mL，不适用于有效期短（24~72小时）、产量低的生物制品的快速放行检测。
分子检测方法作为替代方法可以弥补药典法的局限，所以商业化支原体检测试剂盒和分子平台应运而生。当分子检测方法的灵敏度达10 CFU/mL时，可替代培养法；达到100 CFU/mL时，可替代指示细胞培养法。
NIH实验医学部门先对十种自制支原体菌株分别进行梯度稀释（1000 CFU/mL至1 CFU/mL）后，再使用不同品牌试剂盒进行重复检测的方法进行测试，除Biofire支原体检测系统因成本考虑进行3重复测试外，其余四种试剂盒均由两名研究员分别进行6重复测试。因不同支原体检测试剂盒之间存在灵敏度差异，进一步对MycoSEQ、VenorGEM和MycoTool三种支原体检测试剂盒检测Ct值进行线性分析。
此外，将105 cells/mL肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）作为基质，分别加入肺炎支原体、莱氏无胆甾原体和猪鼻支原体三种支原体菌株进行额外测试，排除基质干扰试剂盒灵敏度可能性。
此研究结果显示，当TILs作为基质时不会对支原体检测试剂盒检测体系造成干扰（表1）。
表1 此研究中进行的TILs基质干扰检测实验结果
注：绿色表示所有重复均检出；橙色表示检测到50%重复；红色表示所有重复均未检出。
仅基于本研究检测限结果可知，Biofire支原体检测系统灵敏度最高，且并非所有试剂盒均能达到检测限≤10 CFU/mL（表2），其中MycoSEQ支原体检测试剂盒和MycoTool支原体检测试剂盒检测结果最相近，具有相似的检测线性范围，多数支原体可以在稀释103至104倍时被检测到，MycoSEQ支原体检测试剂盒Ct值更低（图1）。
表2 此研究中支原体菌株检测限测试结果
注：绿色表示检测限≤10 CFU/mL，满足EP和JP对替代方法的要求。红色表示检测限≥1000 CFU/mL。
图1 检测限线性范围
注：红色表示MycoSEQ支原体检测试剂盒；黑色表示VenorGEM支原体检测试剂盒；蓝色表示MycoTool支原体检测试剂盒。
A：莱氏无胆甾原体；B：鸡毒支原体；C：精氨酸支原体；D：人型支原体；E：肺支原体；F：肺炎支原体；G：发酵支原体；H：唾液支原体；I：猪鼻支原体；J：硬蜱螺原体。
五种支原体检测试剂盒中仅ATCC支原体检测试剂盒可检测出硬蜱螺原体，其余试剂盒均不能检出硬蜱螺原体，但就发酵支原体而言，仅ATCC支原体检测试剂盒检测限未达≤10 CFU/mL，未达到EP和JP规定的可替代传统法的灵敏度要求（表2）。
螺原体可能在今后医学及生物制药行业将占据重要地位，所以对其检测不应被忽视，试剂盒的适用性应作为试剂盒选择的依据之一，必须选择合适的支原体检测试剂盒对细胞治疗产品进行支原体污染检测。
NIH实验医学部门对五种商业化支原体检测试剂盒进行了全面的比较评价，结果表明，结合EP和JP对替代方法灵敏度要求，商业化试剂盒性能参差不齐，故待测样品的原辅料来源和检测目的不同时，对试剂盒进行性能验证极其必要。
验证需要考量如下几点：
不同试剂盒对不同菌株的灵敏度差异显著
全取样一体化检测，显著提升灵敏度
试剂盒选择需结合产品特性及样品基质，企业需自行性能确认
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