安捷伦 | Seahorse XF成像和归一化系统对XF数据进行归一化

在推荐的工作流程中，Hoechst 33342与XF分析试剂盒加样策略中的最后加样试剂结合使用。将染料与用于XF分析的试剂盒试剂一起直接加样。加入的染料在最后三到五个测量周期中与细胞核结合。由于Hoechst 33342标记的细胞核可在没有任何额外清洗步骤的情况下进行检测和识别，因此在完成XF分析后，可采用Cytation 成像设备立即进行细胞成像。这些细胞数通过XF成像和细胞计数软件计算得出（图1）。

图1. XF成像和归一化系统的典型工作流程

通过假设两个基础代谢速率OCR和ECAR与每孔细胞数成比例相关，将各种细胞类型以三到五种不同的密度接种。只有当细胞对细胞密度变化没有任何生物响应时，这种假设才有实际意义。在所测试的细胞系中，大多数基础代谢速率与通常推荐用于XF分析的标准接种密度范围内的细胞密度呈良好线性相关性。图2显示了此数据归一化解决方案如何用于XF细胞能量代谢表型测试的示例。将 RAW264.7巨噬细胞以四种不同细胞密度在分析前一天进行接种，然后采用安捷伦Seahorse XFe96分析仪分析它们的代谢表型。与标准XF细胞能量代谢表型测试的唯一区别在于，同一加药口（箭头）包含可渗透细胞的 Hoechst 33342 染料以及寡霉素/FCCP 化合物。如图2A所示，OCR和ECAR随接种密度成比例增加。

完成XF分析后，通过成像和细胞计数软件采集荧光图像并计数，如图2B所示。图2C显示了归一化后的数据，其中将代谢速率除以软件计数得到的细胞数。在应用细胞计数归一化后，OCR和ECAR动力学曲线都发生重叠，特别是细胞加样寡霉素和FCCP之前的基础速率。并只有在密度差异没有造成生物学变化时，归一化后才会出现这种数据收敛。因此，数据归一化可以鉴定与细胞密度差异相关的真实生物学变化。如图 2C所示，FCCP对OCR的影响随细胞密度而变化，而寡霉素导致的ECAR升高不受细胞密度影响。

图 2. 使用XF成像和归一化系统对XF细胞能量代谢表型测试数据进行归一化。如图所示，在分析前一天以不同细胞密度接种RAW264.7细胞。在XF细胞能量代谢表型分析中，将 Hoechst 33342（终浓度 2 µmol/L）与寡霉素/FCCP混合物共同加入（箭头）；A)归一化前的数据；B)采集的图像和相应核计数结果；C)归一化结果。

通过使用在体外表现出不同形态特征的不同细胞类型进一步验证该方案和工作流程。以五种不同细胞密度接种具有各种核大小和分布的多种细胞系，采用XF细胞能量代谢表型测试检查代谢表型。如上所述，Hoechst 33342包含在寡霉素/FCCP 混合物中。采用由XF成像和细胞计数软件计算得到的细胞数对数据进行归一化。图3显示了在应用归一化前后六种代表性细胞系的比较汇总。如图所示，除少数极端情况外，在应用细胞计数归一化因子后所有基础代谢速率收敛良好。

图3. Seahorse XF96微孔板上多种癌细胞系的XF细胞能量代谢表型测试数据的归一化。使用XF细胞能量代谢表型报告生成器获得以五种不同细胞密度接种的六种不同细胞系的细胞能量代谢表型。比较每种细胞系归一化前（左列）和归一化后（右列）的代谢表型图。

RAW264.7小鼠巨噬细胞被广泛用作病原刺激引起的体外促炎活化的模型。体外暴露于细菌脂多糖(LPS)/IFN-γ可触发与活化相关的代谢变化，RAW264.7巨噬细胞从氧化表型转换为糖酵解表型。这一结果可通过ECAR的增加和OCR的减少得到证明。然而，应将代谢速率归一化以进行定量比较，因为巨噬细胞活化与增殖速率变化紧密相关，活化后增殖速率大大降低。图4为数据归一化如何影响XF细胞线粒体压力测试结果的数据解析的示例。图4A是归一化前的数据汇总，单独的LPS或LPS/IFNγ共刺激严重抑制了基础线粒体呼吸和备用呼吸能力(SRC)。

然而，当数据按细胞数进行归一化时，尽管单独的LPS抑制了线粒体呼吸，但这一影响更针对SRC，而大部分的基础呼吸得到保留。相反，LPS/IFNγ共刺激完全抑制了线粒体功能，包括基础呼吸（图4B）。对XF糖酵解速率测定结果的解析受数据归一化的影响更大（图5）。在没有归一化的情况下，巨噬细胞的糖酵解速率在基础测量中略微下调，对于活化时的代偿活性下调更严重（图5A）。而根据图4B中所示的归一化数据，基础糖酵解受LPS刺激明显上调，且IFNγ共刺激使基础糖酵解速率达到最大。

图 4. 数据归一化对XF细胞线粒体压力测试结果的影响。将 RAW264.7细胞在100 ng/mL LPS单独存在下或与 20 ng/mL IFN-γ同时存在下培养过夜，通过XF细胞线粒体压力测试分析线粒体功能。A) 归一化前；B) 归一化后。

图 5. 数据归一化对XF糖酵解速率测定结果的影响。将 RAW264.7细胞在100 ng/mL LPS 单独存在下或与20ng/mL IFN-γ同时存在下培养过夜，通过XF糖酵解速率测定对巨噬细胞活化后的糖酵解活性变化进行分析。比较总体糖酵解质子释放率(glycoPER) 动力学数据以及基础和代偿糖酵解速率；A) 归一化前；B) 归一化后。

通过Seahorse XF分析仪和Cytation成像设备为XF成像和归一化系统提供了一种简单、快速的无缝式工作流程，可重现地生成每孔细胞计数，以执行XF数据的归一化。通过XF成像和细胞计数软件获得细胞图像和计数，数据可自动同步并记录在Wave XF结果文件中。这使用户能够更成功地执行XF分析且可确保数据完整性，从而实现最佳且有效的数据解析。