Immunoway | 实验干货 - 一文了解WB常见问题“带跑偏”- 大数跨境

睿捷生物

2026-01-15

导读：对于大多数接触 Western Blot（WB）实验的科研工作者来说，WB 很少一帆风顺。

对于大多数接触 Western Blot（WB）实验的科研工作者来说，WB 很少一帆风顺。常见的问题包括：无信号、杂带过多、条带形状异常（如连成直线、弯曲、拖尾等），以及条带位置与预期分子量不符。关于这些常见问题，我们此前已在文章《Western Blot〡一文全面分析常见问题及解决方案》中进行了系统梳理。

而本文将聚焦一个特别令人困惑的现象：为什么 WB 条带“跑偏”了？明明目标蛋白的理论分子量是 X kDa，结果却出现在其他位置——这样的结果还能信吗？

要解答这个问题，首先要厘清两个关键概念：理论分子量与观测分子量。理论分子量：根据蛋白质氨基酸序列计算得出的质量（单位：kDa）；观测分子量：在 SDS-PAGE 凝胶电泳中，蛋白实际迁移位置所对应的表观分子量。

在 WB 实验中，这两者常常不一致——这并非实验失败，而是由多种生物学和生化因素导致的正常现象。接下来，我们将结合具体案例，深入解析WB 条带“分子量不符”的常见原因，帮助你判断：哪些“异常”其实是合理的，哪些才真正需要排查！

1.蛋白的翻译后修饰

常见的蛋白修饰包括糖基化修饰（N/O糖基化）、磷酸化、泛素化、乙酰化和甲基化等。其中糖基化修饰对蛋白分子量的增加额外明显，可能会让分子量增加10~50kD。磷酸化不会显著增加分子量，因此我们在WB实验中磷酸化条带和未磷酸化条带几乎是一个位置。其中的案例有

1.1 Nrf2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NF-E2 相关因子 2）

Nrf2作为氧化应激的标志性产物，目前已经是关注比较多的靶点。Nrf2的人源氨基酸长度为605个氨基酸，其理论分子量大约为68kD。然而在大多数WB检测条带出现在100kD的位置（图1），其核心原因为存在大量糖基化和泛素化等修饰位点。

（图1：YM8624,不同样品Nrf2 WB检测结果）

1.2 EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor，表皮生长因子受体）

EGFR 是 HER/ErbB 受体酪氨酸激酶家族（HER1/ErbB1）的核心成员，在细胞增殖、分化、迁移和存活中起关键作用。其异常激活是多种癌症（尤其是非小细胞肺癌）的重要驱动因素。EGFR人源氨基酸序列为1210个氨基酸，理论分子量约为134kD，而实际观测条带大约为180kD（图2）。

（图2：YM8344,不同样品EGFR WB检测结果）

1.3 Integrin αE（Integrin alpha-E，整合素αE）

Integrin αE是整合素家族中一个具有高度组织特异性表达的亚单位，主要与 β7 亚单位 形成异源二聚体 αEβ7（即 CD103/CD18），其核心功能是介导上皮内淋巴细胞。Integrin αE人源氨基酸序列为1179，理论分子量大约130kD，实际观测条带大约为150kD（图3）。

（图3：YM9419,大小鼠脾脏Intrgrin αE检测结果）

2.蛋白存在剪切体或者活化形式

蛋白的剪切（cleavage）是蛋白质翻译后成熟或功能调控的重要机制。许多蛋白最初合成的是无活性或前体形式（precursor/pro-form），需经特异性蛋白酶切割后才具备生物学活性，或产生具有新功能的片段。这类蛋白发生剪切或者活化（常见于分泌蛋白切割信号肽）时，分子量会发生变化。

2.1 caspase蛋白家族

Caspase家族与细胞凋亡有关联，其中caspase 8、3、7与外源性受体信号凋亡有关。caspase 9、3、7与内源性凋亡（线粒体途径）相关。而caspase 1与炎症小体有关，下游激活切割IL-1B、GSDMD切割来诱发细胞焦亡。

Caspase 3前体分子大小为35kD，活化后其常见切割位点为Asp175和Asp28，形成17kD的活化条带（图4）。

（图4：YM8294，检测caspase3 全长34kD和17、19kD两个剪切条带）

Caspase 1前体分子量为45kD，常见活化切割位点为Asp297和Asp119，形成20kD的活化条带（图5）。

（图5：YM9369，检测caspase1 20kD活化形式）

Caspase 8前体分子量为55kD，常见活化切割位点为Asp387，形成18kD的活化条带（图6）。

（图6：YM9368，检测caspase8 43kD和18kD活化形式）

2.2 GSDMD（Gasdermin-D，气体素D）

GSDMD是细胞焦亡的执行分子，在先天免疫防御、炎症性疾病和抗肿瘤免疫中扮演关键角色。其激活导致细胞膜穿孔、内容物释放和强烈的炎症反应。GSDMD全长484个氨基酸（人）。其N端序列为aa1~275，为其发挥功能的活性区域。C端序列为aa276~484，作用是在静息状态下与N端结合，抑制N端的活性。其次还包含多个蛋白酶切割位点的链接区，这3个部分共同构成了全长的GSDMD分子。当GSDMD被激活时，链接区被切割，释放35kD的N端（图7），穿孔诱发细胞焦亡。

（图7：YM8489,不同样品检测GSDMD-N序列）

2.3 IL-1β（Interleukin-1 beta，白细胞介素-1β）

IL-1β是一种关键的促炎细胞因子，在先天免疫、炎症反应、发热和多种疾病（如自身免疫病、神经退行性疾病、难治性抑郁）中发挥核心作用。其活性受到极其严格的双重调控：需经 “信号1”转录 + “信号2”剪切 才能释放成熟形式。蛋白前体（pro-IL1β）269个氨基酸（人源），成熟体为153个氨基酸（aa：117~269）（图8）。

（图8：YM4386，检测IL1β 35kD全长、30kD剪切中间体和20kD活化形式）

2.4 TNF-α （Tumor Necrosis Factor-alpha，肿瘤坏死因子-α）

TNF-α是一种关键的促炎细胞因子，在免疫防御、炎症反应、细胞存活/死亡调控及多种重大疾病（如类风湿关节炎、脓毒症、癌症、代谢综合征）中扮演核心角色。它通过与两种受体（TNFR1/TNFR2）结合，激活多条信号通路，具有高度双面性：既可清除病原体和肿瘤，又可导致组织损伤和慢性炎症。

TNF-α前体有233个氨基酸（人源），而活化形式为C端157个氨基酸（图9）

（图9：YM8306，检测TNF-α 26kD全长和18kD成熟序列）

3.蛋白存在跨膜结构导致SDS结合异常

此类情况以膜蛋白为代表。膜蛋白具有疏水性，在高温下煮沸时，膜蛋白倾向于聚集并形成二聚体或多聚体，聚集后分子量变大，造成后续无法检测到条带或检出的条带位置不对，因此热变性温度对膜蛋白检测的影响是极大。因此，在处理膜蛋白样品时，不煮或者低于70度的温度处理样品更佳。其次，膜蛋白通常含有胞外结构域，通常存在糖基化修饰，这也是膜蛋白偏离理论分子量的原因之一。

3.1 Glut-1（Glucose Transporter 1，葡萄糖转运蛋白 1）

Glut-1是一种关键的跨膜糖转运蛋白，负责基础性葡萄糖摄取，在血脑屏障、红细胞、胎盘及多种肿瘤细胞中高表达。其分子量在 Western Blot（WB）中常显著高于理论值（图10），主要受N-糖基化和跨膜结构特性（图11）影响。

（图10：YM8630，不同样品检测Glut1，煮沸与不煮沸条带差异）

（图11：Glut-1存在12个跨膜序列）

3.2 CD系列蛋白

CD 系列蛋白（Cluster of Differentiation，分化簇抗原）是一组表达于细胞表面的膜蛋白，最初通过单克隆抗体鉴定并用于免疫细胞分型。目前已有超过400个CD 分子（CD1–CD371+），涵盖受体、黏附分子、酶、转运蛋白、共刺激/共抑制分子等，是免疫学、血液学、肿瘤学和流式细胞术的核心工具。例如CD86、CD68和CD31观测条带均大于理论分子值（图12）。

（图12：CD86（YM8023）全长329个氨基酸（人源），实际观测条带大约60~80kD。CD68（YM8367）全长354个氨基酸（人源），实际观测条带大约100kD。CD31（YM8207）全长783个氨基酸（人源），实际观测条带大约130kD。）

4.同一靶点蛋白存在其他亚型或者不同物种间氨基酸长度不一致

存在不同分子量的翻译亚型以及物种不同，其氨基酸序列不同液会带来与常见分子量出现偏差的情况。

4.1 Vinculin（VCL，黏着斑蛋白）

Vinculin是一种关键的细胞骨架衔接蛋白，同时还存在组织特异性的亚型Metavinculin，主要在心肌和平滑肌表达（图13）。

（图13：YM8434，检测到Vinculin和Metavinculin）

4.2 EMR1（EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1）

EMR1(鼠源为F4/80)是一种黏附类 G 蛋白偶联受体，在免疫学中具有特殊意义：它是小鼠和大鼠嗜酸性粒细胞。然而，在人类中，EMR1 并不表达于嗜酸性粒细胞，且其功能和表达谱存在显著种属差异。鼠源F4/80氨基酸长度为931个氨基酸，而人源EMR1为886个氨基酸。

以上常见指标，WB得到的条带可能与认知分子量存在差异的正常情况。同时也有其他指标存在类似情况，可以逐步分析。同一指标在不同的检测结果，或者不同文献中都存在报道。例如Nrf2在大多数文献中分子量在100kD左右，但是目前也存在68kD大小的报道。

（参考文献：“Inhibition of macrophage inflammasome assembly and pyroptosis with GC-1 ameliorates acute lung injury；Bin Li；2025.1”）

当存在分子量不对时，可以排除上述各种影响分子量大小的正常情况。同时也可查阅文献求证是否也有相似的条带位置。当排除上述因素后依然存在问题，接下来就可考虑其他的因素了。其中，使用预染Marker时，不同批次纯化得到的蛋白标准品，纯度、染料修饰程度、三维结构略有差别，会改变电泳迁移速率。所以不少厂家声明的“批间差异≤5%”可作为正常参考范围。因此分子量较大的蛋白某次实验略微偏，也可作为正常现象。

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