免疫沉淀的几种类型
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#01
·· 免疫沉淀（IP） ··
是利用固定在磁珠或琼脂糖树脂等固相支持物上的特异性抗体对抗原进行小型亲和纯化的方法。
🔘 图1. 使用预固定或游离抗体的免疫沉淀（IP）示意图
每个步骤包括孵育、树脂收集（离心或磁性装置）以及溶液移除。每个孵育步骤后都要进行洗涤。在第一列（左侧）中，特定蛋白的抗体（单克隆或多克隆）固定在不溶性支持物（如琼脂糖或磁珠）上，随后与含有目标蛋白的细胞裂解物一起孵育。在孵育期间，轻轻搅动裂解物使目标抗原结合到固定抗体上，形成抗原-抗体免疫复合物。随后，将免疫复合物从固相支持物上洗脱，进行目标抗原的性质分析。
也可将游离的未结合抗体加入裂解物中形成免疫复合物，然后利用填料回收复合物。虽然预固定抗体法更常用于IP，但是如果目标蛋白浓度较低、抗体与抗原的结合亲和力较弱，则使用游离抗体形成免疫复合物的方法更好。
#02
·· 免疫共沉淀（co-IP） ··
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通过使用靶蛋白特异性抗体间接捕获与特定靶蛋白结合的蛋白质，从而鉴定生理相关的蛋白质-蛋白质相互作用。co-IP是IP的延伸，它基于IP反应的潜力来捕获和纯化主要靶标（即抗原）以及通过样品溶液中的天然相互作用与靶标结合的其他大分子。因此，实验是称为IP还是co-IP取决于实验的重点是主要靶标（抗原）还是次要靶标（相互作用的蛋白质）。两者区别如下图2和图3。
🔘 图2. IP实验
🔘 图3. co-IP实验
#03
··染色质免疫沉淀（ChIP）和RNA免疫沉淀（RIP） ··
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染色质免疫沉淀分析可用于鉴定基因组中与DNA结合蛋白（如转录因子和组蛋白）结合的区域。在ChIP分析中，在细胞裂解前，使蛋白质与DNA暂时交联固定并剪切DNA。目标蛋白与交联的核苷酸序一起免疫沉淀，取出DNA并进行PCR鉴定、测序、微阵列分析或采用其他方法进行检测。RIP与ChIP相似，除了RNA结合蛋白被免疫沉淀而非DNA结合蛋白。随后，通过RT-PCR和cDNA测序对免疫沉淀所得的RNA进行鉴定。
🔘 图4. RIP实验
#04
·· 标签蛋白IP或基于标签的pull-down ··
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前述IP方法的一个关键局限是，它们依赖能够特异性识别靶蛋白的抗体，需要靶蛋白很少或绝不能与其它胞内靶标发生交叉反应。
pull-down测定是一种类似于免疫沉淀的小规模亲和纯化技术，不同之处在于抗体被其他亲和系统取代。在这种情况下，亲和系统由谷胱甘肽S-转移酶（GST）、多聚组蛋白或链霉亲和素标签蛋白或结合结构域组成，分别被谷胱甘肽、金属螯合物（钴或镍）或生物素包被的琼脂糖珠捕获。固定化的融合标签蛋白充当“诱饵”来捕获假定的结合伴侣（即“猎物”）。在典型的沉降分析中，固定化诱饵蛋白与细胞裂解物一起孵育，在规定的洗涤步骤之后，使用竞争性分析物或低pH值或还原缓冲液选择性洗脱复合物，以进行蛋白质印迹分析或其他检测分析。
🔘 图5. pull-down测定的一般示意图
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