abcam |【谣言粉碎机】别再盲目“煮样”了！条带变大、拖尾、弥散、无信号在等着你【靶点解惑】

蛋白质从细胞质到质膜的转运是信息传递的关键步骤，目前许多药物的靶点都是膜蛋白，这表明高效且正确检测膜蛋白的重要性。

通常情况下，煮样是WB实验流程中的一个必要步骤，将样本缓冲液中的细胞裂解液在100 °C 下煮沸5 分钟，能够帮助蛋白充分变性。难道通用的protocol并不适合膜蛋白的检测？

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若检测的靶标蛋白为多次跨膜蛋白，且煮样后出现蛋白变大、拖尾、弥散、无信号等情况，建议尝试不煮样，可根据样本情况及靶标特性，梯度摸索最适合的孵育时间和温度。

同时，针对以下热门的膜蛋白靶标，小编总结了WB实验中的注意事项，快来看看除了“不煮样”，膜蛋白还有哪些需要注意的实验关键点吧！

点击靶标名称，可查看更多内容关于蛋白功能、特性、表达、定位、异构体及翻译后修饰，以及WB注意事项、阳性及阴性对照、关键控制点等信息！

• ABCA1，Phospholipid-transporting ATPase ABCA1（UniProt: O95477）为多次跨膜蛋白，高温煮样容易导致膜蛋白聚集。若煮样后出现蛋白变大、拖尾或无信号等现象，建议尝试裂解后不煮沸样品。

• 部分细胞系经过刺激诱导后靶标蛋白信号增强（例如：可使用20uM T0901317诱导HepG2细胞16小时），建议查阅产品说明书或文献确认刺激诱导条件。 

• ABCA1实际检测分子量大小约为260kDa，建议选择适用于大分子量蛋白检测的实验条件，例如，在WB实验中使用较低浓度的分离胶（如6~8%）进行电泳；转膜时，建议使用0.45μm的PVDF膜，转膜缓冲液中的甲醇含量可选择10%或更低浓度，同时加入SDS至终浓度为0.1%。

• CPT1A为多次跨膜蛋白，若煮样后出现条带分子量变大、模糊、拖尾等现象，建议尝试不煮样。

• CPT1A定位于线粒体外膜上，若全细胞裂解液检测信号弱，建议尝试提取线粒体组分增强检测信号。 

• CPT1A存在表达特性，在肝脏组织中表达量较低，若检测靶标蛋白含量较弱的样本（eg：HepG2，肝脏组织），建议增加上样量、降低抗体稀释比例提高检测信号，同时建议增加阳性对照。

• CXCR4为多次跨膜蛋白，高温煮样容易导致膜蛋白聚集。若煮样后出现蛋白变大、拖尾或无信号等现象，建议尝试裂解后不煮沸样品。

• 若全细胞裂解液检测信号弱，可尝试提取细胞膜组分富集靶标蛋白。

• 为避免磷酸化对CXCR4检测产生影响，我们建议在一抗孵育前使用λ蛋白磷酸酶处理膜。

• E Cadherin是一个膜蛋白，在胞外区有许多钙粘蛋白的重复序列，可能遮蔽抗原表位，因此建议超声裂解以暴露抗原表位，便于抗体结合。 

• 在不同样品中可能检测到分子量约为80kDa，97kDa和120kDa的一条或多条条带。

• 不同组织或细胞中，E Cadherin表达量可能不同，建议设置阳性对照（例如HT-29细胞裂解液）。

• GLUT1存在糖基化修饰，实际检测分子量约40-60 kDa（预测分子量：54 kDa），可能存在多条条带现象。

• 我们不建议对裂解后的样本进行煮样。GLUT1为多次跨膜蛋白，高温煮样容易导致蛋白聚集，不能有效进入胶中，出现条带变大、模糊或拖尾等现象。

• 我们不建议对裂解后的样本进行煮样。GLUT1为多次跨膜蛋白，高温煮样容易导致蛋白聚集，不能有效进入胶中，出现条带变大、模糊或拖尾等现象。

• Mannose Receptor（CD206）主要在巨噬细胞和树突状细胞表达，也可在淋巴、肝和脾内皮、肾系膜细胞、气管平滑肌细胞和视网膜色素上皮中表达。建议选择表达量较高的样本作为阳性对照，例如肺。 

• Mannose Receptor（CD206）是一种预测约166 kDa的膜结合蛋白，煮样可能会引起蛋白聚集，若无信号，建议样本制备后不煮样。

• Mannose Receptor在大脑中的表达在生命的第一周达到最高，此后急剧下降，在整个成年期保持在低水平。因此在正常全脑裂解液中，很难检测到信号。 

• Mannose Receptor还有存在可溶性的形式，可溶性CD206存在于人树突状细胞、人巨噬细胞和小鼠巨噬细胞的培养基中，也存在于人和小鼠血清中。研究发现，CD206的可溶形式分子量比膜结合形式更小。 

• Mannose Receptor还存在翻译后修饰，例如糖基化修饰，因此实际检测分子量可能比预测分子量大。

• 在炎症反应过程中，IL-4和IL-13会刺激Mannose Receptor（CD206）表达会上调。对于部分细胞如RAW264.7，IL-4和IL-10处理会增加CD206的表达，因此刺激处理有利于解决WB实验时无信号或信号弱等问题。

• P-糖蛋白多个位点存在糖基化修饰，可能影响蛋白条带的迁移。实际检测条带大小可能在160-200 kDa，而不是预测的141 kDa。

• 由于蛋白糖基化的特点，通常会在膜上150-300 kDa位置出现模糊的拖带（如图3、4和5所示）。不建议裁膜，以防丢失目的条带。 

• 由于P-糖蛋白是多次跨膜蛋白，高温煮样容易导致蛋白聚集，强烈推荐在裂解后不煮沸样品，防止出现无信号现象。 

• 由于P-糖蛋白是多次跨膜蛋白，不同的裂解方式对蛋白的提取影响较大。推荐根据实验样本不同，对裂解方式进行优化。 

• P-糖蛋白在不同组织细胞中的表达不同，有些样本可能会出现弱表达或无表达的情况。请选择合适的实验样本，推荐使用阳性对照，以确认实验体系没有问题。

• SREBP1是一个多次跨膜蛋白，煮样可能导致蛋白聚集。如果煮样后检测不到信号，推荐提取蛋白时不煮样。 

• P-糖蛋白在不同组织细胞中的表达不同，有些样本可能会出现弱表达或无表达的情况。请选择合适的实验样本，推荐使用阳性对照，以确认实验体系没有问题。 

• 由于SREBP1会经历可变剪切，因此存在多种异构体，WB检测时有可能出现多条条带现象。

• 建议不要裁膜，或者保留40-250 kDa范围，防止蛋白信号丢失。