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知识盘点| RNA提取是玄学？要观方位，择吉时？
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LIFE DIARY
【Date：2022.05.13】
KNOWNOWLEDGE
实验室师兄师姐每次提RNA
都要整理仪容仪表
实验台也是擦的非常亮堂，一尘不染
最后再双手合十，嘴里念叨着什么
这才开始提取RNA
原因是因为玄学问题？
还是什么看不见的力量控制着科研狗？
究其原因，
原来是提取RNA时
我们经常遇到的问题太难搞，
随机出现，
让科研狗叫苦不迭~
问题集中：
(1)RNA产量较低；
(2)RNA有严重的盐类污染；
(3)RNA有严重的有机溶剂污染；
(4) 样品降解等问题。
现在有一件“神器”，能够解决科研狗的烦恼，快来pick,10分钟提取RNA！
LIFERECORD
一.UUBIO组织、细胞RNA快速抽提提取试剂盒优势
1、简单快速，仅需裂解细胞、加乙醇混匀后过柱、洗涤、洗脱等几步，大约10分钟即可做完提取RNA；
2、试剂安全无毒，不含苯酚，无需氯仿、异丙醇、DEPC水（灭菌的ddH2O即可），保护身体健康；
3、结果稳定，重复性好，对操作的要求不高，能够更高效的得到结果，不会出现RNA丢失的状况；
4、样品多时，同样简单：例如提取20个样品的RNA仅需约30分钟，而用Trizol方法提取至少需要2.5小时以上。
5、所需样品量少：最少能提取2万个常规细胞或1mg组织的RNA（Trizol至少需要10万细胞或5mg组织才能提取得到RNA，太少得不到结果）
LIFERECORD
二.实验流程与结果
LIFERECORD
三.使用建议
1.用于细胞样品时建议用6孔板或35mm培养皿培养细胞，培养至合适的密度进行RNA提取（24孔板培养的细胞培养至90%以上的细胞密度也可使用）。不建议100mm培养皿培养的细胞直接进行RNA提取，否则可能导致细胞裂解不充分或因核酸过量导致离心柱堵塞或导致基因组残留。
2.用于组织样品时建议用于内脏组织、肿瘤组织等，不适用于皮肤等坚韧的组织。该试剂盒可提取5x104~3x106个细胞或10~100mg组织的RNA，对于T细胞/B细胞等体积很小、RNA含量很低的细胞，建议增加细胞数到至少1x106以上。
常用问题解决方案
RNA产量过低，或用已经验证过的引物检测基因表达，检测到的内参基因Ct值偏大，或无法做出正常的扩增结果。
解决办法：
a. 检查所使用的试剂是否受到污染：建议试剂盒开封后, 每种buffer分装为2份每次使用时应严格按照规溯作，防止交叉污染。
b. 溶解好的引物应该分装为小份冻存，以减少引物降解及降低污染的可能性。
c. 检查操作流程是否正确，例如：
1. 除DNA酶以外的所有试剂均须室温保存。若冷藏保存，应提前取出，温度恢复至室温之后方可使用。整个RNA提取的操作过程必须在室温进行，不可置于冰上（直至洗脱离心后得到 RNA方可置于冰上），以避免其间产生不溶物堵塞离心柱；
2. Wash Buffer使用前需加入48毫升无水乙醇混匀才可使用；
3. 细胞或组织裂解产物，上柱前需要加入等体积的无水乙醇，充分混匀后加入离心柱中离心；
4. 可选步骤：若实验对基因组的少量残留极其敏感，可用试剂盒附赠DNA酶处理：RNA经wash buffer清洗一次后，按照每个样品2 μl DNase + 2 μl 10x Reaction buffer加16 μl DEPC水（或Elution Buffer），混匀后加入离心柱中央，室温放置5分钟，然后加入 Wash Buffer清洗一次去除DNA酶，进行后续操作；
5. 洗涤时需用12,000 g高速离心充分去除Wash Buffer，然后开盖晾干2分钟；
6. 洗脱液的体积可以根据需要在一定范围内调整（一般20-50μl，最少不可少于10 μl ,否则无法充分溶解RNA）,以浓度满足后续实验需求为宜。重复洗脱一次及延长放置时间至5分钟均可提高RNA产量。
7. 若细胞体积较大以往采用TRIzol试剂提取RNA时需用100 mm培养皿培养细胞, 建议使用本试剂盒时仍然使用35mm培养皿培养细胞，本试剂盒最低可提取5万个左右常规细胞的RNA（T、B细胞等体积极小的细胞除外），能满足绝大多数逆转录和qPCR的实验需要。经测试，本试剂盒最多大约可提取30μg左右的总RNA。
8. 组织匀浆应在PBS中充分研磨成细胞悬液，切勿在lysis buffer中匀浆。
文献引用：
Zhi S, Congcong Z, Zhiling G, Yihan Q, Yijing X, Guanjie L, Fang W, Xuehua S, Hongjie L, Xiaoni K, Yueqiu G. Quantitative proteomics of HFD-induced fatty liver uncovers novel transcription factors of lipid metabolism. Int J Biol Sci 2022; 18(8):3298-3312.
