在当今快速发展的生物医学领域，一种被称为“纳米抗体”的创新技术正逐渐崭露头角，为疾病的诊断和治疗带来了革命性的变革。今天，让我们一起深入了解纳米抗体的应用，看看这些微小但强大的分子如何成为攻克多种疾病的“明星抗体”。接下来我们根据本篇文章了解纳米抗体的来源以及应用。
纳米抗体，源于骆驼科动物体内的一种特殊抗体，以其体积小巧、稳定性强、特异性高等特点，在医疗界引发了广泛关注。它们不仅比传统抗体更易于穿透组织，还能保持高度的抗原结合能力，这使得纳米抗体成为了理想的诊断和治疗工具。
在双峰驼的第6号染色体上，存在着近20个分散分布的IGHV和IGHVH基因，这些基因位于7个IGHD基因和7个IGHJ基因簇的上游。紧接着的是编码各种免疫球蛋白重链恒定区的一系列基因。而第28号染色体则承载了免疫球蛋白κ轻链的基因座（图中未显示的是位于第32号染色体上的λ轻链基因座）。
当B细胞内的IGHV-D-J和IGKV-J基因发生重组后，表达就会导致经典异四聚体H2L2抗体的形成（图示●3；抗原结合部分或称表位以蓝色线条表示）。如果在重组过程中使用的是IGHVH基因而非IGHV基因，并且它与三个专门的重链基因之一（IGHG2A、IGHG2C或IGHG3，这些基因不编码CH1结构域）共同表达时，则会在体内形成同源二聚体H2 HCAbs（图示●4；凸起的表位用蓝色线表示）。
通过DNA重组技术，作者可以利用经典抗体中的两个独立基因片段组装出更小的Fab片段（图示●5），或者生成scFv片段（图示●6）。此外，作者还可以从HCAbs中克隆出单个外显子来编码单体Nb（VHH）结构域（图示●7）。
分子量小，组织渗透能力强，仅 12-15 kDa，是传统抗体的 1/10；这种小体积使得纳米抗体能够更容易地进入细胞内部和难以接近的抗原区域。
免疫原性低，纳米抗体的结构和人源抗体重链可变区VH结构非常相似，包含三个高变区(hyper variable region, HVR)和其两侧的四个骨架区(framework region, FR)，且其基因同源性达90%。这意味着纳米抗体的免疫原性比较低；
纳米抗体和VH结构示意图（来源于网络）
氨基酸序列一级结构示意图（上），菱形块标记的位点为纳米抗体的关键氨基酸，黄色粗线为二硫键。下图分别为VH和纳米抗体的蛋白折叠示意图。
特异性强，识别蛋白天然构象；和IgG的VH相比，纳米抗体VHH的CDR3区域更长，弥补了VL domain的缺失。CDR3区域主要决定了纳米抗体VHH的特异性并维持了和抗原的强结合。纳米抗体的 CDR3 区域可以接触到传统抗体不能接触的抗原表位；
IgG VH和重链抗体VHH的CDR和FR区域示意图（来源于网络）
CDR3区域较长且变异多，能够结合多样的抗原。同时，其特殊的FR2氨基酸残基组成和凸形的抗原结合位点也增强了其与抗原的结合能力。使得抗体亲和力高，与抗原发生特异性结合时更容易且紧密、稳定；同时具有良好的水溶性。
纳米抗体VHH其内部存在环间二硫键，这些额外的二硫键帮助其在恶劣环境中仍然可以维持构象的稳定，使纳米抗体有很好的构象和热稳定性，在高温、蛋白酶、促溶剂和极端pH的条件下是稳定的；
结构简单，仅一个重链可变区，易于人源化；易于构建多重特异性抗体；
可以通过噬菌体展示纳米抗体文库快速筛选，既在哺乳表达系统中表达，又可以在大肠杆菌表达系统中表达；
基因工程抗体，确保抗体批次间的一致性；
在科研、诊断、药物多领域都有广泛应用
01
（Early Phase I Study of a 99mTc-Labeled Anti-Programmed Death Ligand-1 (PD-L1) Single-Domain Antibody in SPECT/CT Assessment of PD-L1 Expression in Non-Small Cell Lung Cancer doi:10.2967/jnumed.118.224170）
纳米抗体在临床前和临床模型中都显示出巨大的分子成像潜力 。由于其低分子量 （∼15 kDa），可通过肾脏从循环中快速清除，同时保持高靶标结合电位。目前有学者开发了一个六组氨酸标记的抗 PD-L1 单抗原库，该库与人 PD-L1 特异性结合，而不阻断 PD-1/PD-L1 相互作用。由于抗 PD-L1 免疫治疗药物旨在与 PD-L1 的不同结构域结合，因此不太可能干扰抗 PD-L1 单抗与 PD-L1 的结合，因此可能允许通过影像学检查密切监测抗 PD-L1 免疫治疗。最近的研究表明纳米抗体在核医学成像方面的潜力。
02
（Phase I Study of 68Ga-HER2-Nanobody for PET/CT Assessment of HER2 Expression in Breast Carcinoma doi:10.2967/jnumed.115.162024）
在Marleen Keyaerts的研究中者注射0.01mg Ga-HER2纳米抗体可用于患者体内脏器成像。
由于纳米抗体具有分子量小，高通过率等有点，作为中和抗体已经是纳米抗议一个热门的应用方向。
（纳米抗体作为中和抗体应用图示）
（A potent bispecific nanobody protects hACE2 mice against SARS-CoV-2 infection via intranasal administrationdoi: 10.1016/j.celrep.2021.109869）
在XiLin Wu的研究当中，作者分离的3种纳米抗体（ Nb15-Fc、Nb22-Fc 和 Nb31-Fc）对SARS-coV-2表现出了治疗效果。并且作者将这3种纳米抗体组合成了一个3聚体。其3聚体对人血清白蛋白和SARS-coV-2表现出了双特异性。
（A potent bispecific nanobody protects hACE2 mice against SARS-CoV-2 infection via intranasal administrationdoi: 10.1016/j.celrep.2021.109869）
作者在 Vero E6 细胞中研究了 Nb15-Fc、Nb22-Fc 和 Nb31-Fc 对 SARS-CoV-2 活病毒的中和活性。所有三种 Nb-Fc 均表现出有效的中和活性（图1A）。通过 SARS-CoV-2 假病毒中和试验验证了中和效力（图1B）。IC50 值且与报道的超强中和抗体或 Nbs 的值相当。这些 Nbs 对其他冠状病毒的交叉中和也在假病毒测定中进行了评估，结果表明这三种 Nb-Fcs 不抑制中东呼吸综合征 （MERS）-CoV 或 SARS-CoV 假病毒（图1C-D）。
纳米抗体可以用于正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）、近红外荧光成像（NIR）等多种成像技术中。例如，标记了放射性核素或荧光探针的抗HER2纳米抗体已经被用来检测和定位HER2阳性肿瘤。
（Nanobodies in cancerdoi:10.1016/j.smim.2020.101425）
感染性疾病诊断及治疗
纳米抗体能够特异性地结合病原体，如病毒或细菌，因此可用于快速诊断特定类型的感染。通过将纳米抗体与荧光物质或其他示踪剂结合，可以实现高灵敏度的病原体检测。
在SCHOOF团队于2020年发表在SCIENCE上的论文证实了对实验小鼠进行纳米抗体吸入式给药治疗，证明了针对新冠病毒进行吸入式治疗的可行性及有效性。
（An ultrapotent synthetic nanobody neutralizes SARS-CoV-2 by stabilizing inactive Spike:10.1126/science.abe3255）
心血管疾病
纳米抗体被设计用于靶向血管细胞粘附分子-1（VCAM-1），以帮助识别动脉粥样硬化病变，并进行超声成像；
使用靶向 VCAM-1 （MB） 的纳米抗体从微泡中减去对比增强超声 （CEU） 的微泡管腔内皮表面的对比增强超声的信号强度。
（Ultrasound Molecular Imaging of Atherosclerosis With Nanobodies: Translatable Microbubble Targeting Murine and Human VCAM (Vascular Cell Adhesion Molecule：10.1161/ATVBAHA.119.313088）
炎症性疾病和其他复杂疾病
纳米抗体可以作为亲和试剂来开发针对特定生物标志物的诊断工具，从而帮助监测疾病的进展或治疗效果。
Nachit团队于2023年发表在Nature子刊上的研究表明纳米抗体 (99mTc-cAbVCAM1-5)应用于肝脏炎症分子成像。
（Molecular imaging of liver inflammation using an anti-VCAM-1 nanobody：10.1038/s41467-023-36776-7）
纳米抗体可以作为标记物，用于识别特定的细胞表面标志物，从而对不同类型的细胞进行区分和计数。由于其体积小、亲和力高，能够更有效地渗透进入细胞内部，使得检测更加准确。
利用纳米抗体的不同抗原结合特性，可以在同一实验中使用多种纳米抗体同时标记不同的靶标。这有助于提高检测效率，并允许对复杂的细胞群体进行详细的表征；
在流式细胞术中，纳米抗体可用于将特定的细胞类型从混合群体中分离出来。例如，通过偶联磁性纳米颗粒的纳米抗体，可以利用磁场实现细胞的分离和富集；
纳米抗体可以设计成生物传感器，用于检测特定的生物分子或细胞事件。这种特性使其能够在细胞水平上实现灵敏和实时的检测，这对于流式细胞术来说是非常有价值的；
由于纳米抗体的小尺寸，它们能更好地接近细胞表面受体，可能提供比传统抗体更强的信号强度，这对于低表达水平的蛋白检测尤为重要；
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