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STEMCELL | CRISPR干扰-一种整合iPSC衍生神经元模型的方法

STEMCELL | CRISPR干扰-一种整合iPSC衍生神经元模型的方法 睿捷生物
2024-07-25
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导读：神经退行性疾病的遗传图谱包含多种影响细胞通路的基因，这些通路对多种神经元和神经胶质细胞类型产生影响。利用患者


神经退行性疾病的遗传图谱包含多种影响细胞通路的基因，这些通路对多种神经元和神经胶质细胞类型产生影响。利用患者诱导的多能干细胞 (iPSC) 进行疾病建模，可以在生成与疾病相关的关键细胞类型的同时保留导致神经退行性疾病的基因组变异。


研究者使用CRISPR干扰（CRISPRi）等技术，可以对这些与疾病相关的变异的影响进行建模或识别改变疾病表型的基因。本期我们和大家一起走进CRISPRi了解其在iPSC衍生神经元模型中的应用1。


为什么选择CRISPRi？

CRISPR/Cas9系统原本是细菌在漫长进化史中演化出的防御机制，CRISPR是一种存在于细菌和其他一些单细胞生物中的DNA序列，而Cas9是一种细菌蛋白质，可通过与CRISPR序列相互作用来实现基因编辑。CRISPR干扰技术（CRISPRi）是基于CRISPR/Cas9技术进行改造，它利用催化失活的Cas9（dCas9），通过替换每个内切酶结构域中的某些氨基酸。这种修饰会产生一个核糖核蛋白（RNP）复合物，该复合物可以引导和结合靶DNA，并干扰RNA聚合酶（RNAP）以抑制转录起始或延长。与CRISPR/Cas9系统的敲除相比，CRISPRi通过在诱导型启动子下表达dCas9或sgRNA来实现基因的可逆敲低，从而为基因调控提供更大的灵活性2。

与RNAi技术相比，CRISPRi具有多种优势。CRISPRi具有高度特异性，脱靶效应更少；CRISPRi筛选也更具可重复性，并且总体上更有效。由于其在细胞核中抑制基因转录的作用，它还可以靶向启动子、增强子和其他基因组调控区域，从而可以筛选更广泛的遗传元件。

与CRISPR/Cas9技术相比，CRISPRi也具有多种优势。CRISPR/Cas9在每个细胞中产生不同的突变，从而产生具有各种基因表达、基因剪接和/或蛋白质活性水平的混合细胞群。CRISPRi不会诱导永久性基因组修饰，从而可以实现可逆性基因沉默，并且由于缺乏核酸酶活性，不会导致脱靶突变的积累，CRISPRi沉默的非永久性特性有利于纵向表达。CRISPRi更适合用于研究必需基因的功能，但是这些基因在被CRISPR/Cas9编辑时可能会诱导细胞死亡。

与CRISPR/Cas9的持久性效应相比，CRISPRi的瞬时性在某些情况下是一种优势，但同时也带来挑战。为了保持基因沉默，必须保持dCas9和sgRNA的表达，而这在神经元分化过程中可能会很困难，这会导致CRISPRi机制在长时间培养过程中沉默。


iPSC衍生神经元的功能优势

iPSC技术的出现使得各种神经元亚型能够分化，包括多巴胺能神经元、谷氨酸能神经元和胆碱能神经元以及星形胶质细胞和小胶质细胞等重要的组织特异性神经胶质细胞。来自患者的iPSC衍生神经元保留了其遗传背景和致病突变，这使它们成为了解遗传对特定细胞亚型疾病的影响的重要模型，例如帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病以及神经系统疾病等。

重要的是，iPSC重编程可以“重置”关键的衰老特征，如表观遗传记忆和代谢衰老，与直接诱导的神经元相比，这意味着iPSC衍生的神经元可以转化为与年龄相关的神经退行性疾病。

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CRISPRi在iPSC衍生细胞中的应用

CRISPRi可与各种细胞模型整合，如正常和患者来源的神经元、神经胶质细胞和类器官，可用于从正常神经元创建新的疾病模型，并使用患者神经元了解致病突变的影响。此外这些细胞模型适用于各种单读数筛选，例如基于FACS的筛选，以及具有更复杂读数的筛选，例如遗传相互作用、细胞绘画和组学。

图1 CRISPRi在患者和对照iPSC衍生细胞中的应用

此外，CRISPRi可以与药物发现方法整合，例如小分子筛选和筛选命中验证。研究者1使用CRISPRi作为工具对SH-SY5Y中研究TFEB和TFE3易位的化合物筛选结果进行靶标确认。初步筛选显示PRKD抑制剂可调节TFEB，然而CRISPRi敲低PRKD2和/或PRKD3未能重现化合物诱导的表型或改变小分子抑制剂的EC50。


技术挑战有哪些？

将CRISPRi与iPSC衍生的神经元整合时需要考虑许多技术因素。在稳定表达dCas9的细胞中，sgRNA引导递送的时间点是一个关键因素，如果通过慢病毒同时递送dCas9和sgRNA，则时间点变得更加重要（图2）。在iPSC阶段，细胞更容易转导，从而获得更多的敲低均质性和更少的病毒使用量，并有可能产生稳定的细胞系。转染的细胞群也可以在分化和下游检测之前通过共表达的抗生素抗性基因或荧光标记进行纯化。


然而，如果敲低时间过早，某些“干扰”可能会影响分化或引起补偿机制，从而影响研究结果的可靠性，例如已经证明CRISPRi敲低PPP1R12C可在iPSC衍生的神经元的汇集CRISPRi存活筛选中提供增殖优势。相反，在分化后期递送sgRNA将避免对先前的模式化过程产生潜在影响，并且得到的细胞群可能具有更高的敲低异质性，但需要更多的病毒来转导。对成熟过程中特定时间点的敲低进行时间控制，如Tet-On诱导的dCas9机制表达可以避免早期敲低干扰分化。

图2 在iPSC衍生的神经元模型中使用CRISPRi的技术考虑


在确定iPSC分化为神经元期间慢病毒sgRNA递送的最佳时间时，需要考虑多种因素。细胞可以作为iPSC、神经元前体 (NPC) 或在神经元成熟期间转染。早期递送sgRNA有可能破坏细胞分化为目的细胞类型，但在转导效率和为下游疾病建模应用创建稳定的基因敲除系的能力方面具有实质性优势。晚期递送sgRNA会因转导效率较低而变得复杂，但其优势在于分化效果受的影响较小。


另外，研究者一些观点如下：

  • 了解神经退行性疾病中致病突变对细胞的影响是了解疾病机制和治疗方法的重要工具。使用CRISPR调节基因表达是了解遗传变异与细胞功能影响之间关系的关键工具。

  • CRISPRi可以强效、持续地敲低与疾病相关的神经元和神经胶质细胞类型中的基因，并且能够使用汇集的全基因组筛选来识别新的生物学。CRISPRi还可用作敲低相关细胞类型中的致病突变的工具，以模拟患者的神经元。

  • 将CRISPR引导与成像/选择标记多重化将使CRISPRi实现创新应用，这些应用包括大规模GI映射和组学读数，以及细胞绘画等特定应用，还能识别改变不完全渗透突变所致风险的基因。


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参考文献

1.Franks SNJ, Heon-Roberts R, Ryan BJ. CRISPRi: a way to integrate iPSC-derived neuronal models. Biochem Soc Trans. 2024 Apr 24;52(2):539-551. doi: 10.1042/BST20230190. PMID: 38526223; PMCID: PMC11088925.

2.Byun G, Yang J, Seo SW. CRISPRi-mediated tunable control of gene expression level with engineered single-guide RNA in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 2023 May 22;51(9):4650-4659. doi: 10.1093/nar/gkad234. PMID: 36999618; PMCID:PMC10201414.






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