Western Blot从发明到现在已经过去了三十多年。在实验人员的不断改进下，其检测灵敏度、动态范围以及检测通量方面都有巨大的提升，但其核心的实验技术流程基本上保持不变。以往对Western Blot结果最常见的解读方式是通过肉眼比较条带深浅等进行半定量检测，然而目前，越来越多的期刊编辑和审稿人对Western Blot的实验结果要求更加的严格规范，包括但不限于要求整膜图像，原始数据，标注对应条带大小等，同时也对要求对Western Blot结果进行定量解释。为此，这里我们总结了一些定量Western Blot实验设计要点，重点涵盖样本准备和Western Blot的数据分析，帮助您取得准确可靠的Western Blot实验结果。
实验分组''
与检测在生物体内相对稳定表达的DNA不同，蛋白质在不同的缓冲液和实验条件下其表达、稳定性、构象和活性可能会有显著变化。此外，样本中其他非目标蛋白的污染可能会极大地影响目标蛋白的完整性和活性，因此，在设计Western Blot实验方案与分组时必须小心，以确保案例和对照样本之间的表观差异不是实验条件或样本处理的假象。
常见的可对Western Blot蛋白质表达产生重大影响的因素包括孵育时间和温度，以及处理样本的参数，如组织收集和随后冷冻之间的时间，甚至组织或细胞团块的解冻条件和时间。
■ 图1.Western Blot实验设计分组 ■
样本制备''
样本制备中的几个关键点可能会直接影响最终在膜上条带的密度，如：
1.不当的组织或细胞样本处理，导致样本间蛋白质降解和/或表达的变异，
2.裂解缓冲液中不充分的去污剂、盐和蛋白酶抑制剂，
3.未充分对样本进行匀质化。
通常得到的蛋白裂解物成分非常复杂，含有诸如细胞或组织碎片、脂肪、疏水性蛋白质聚集体、核酸和蛋白酶等污染物，这些都可能直接并负面影响Western Blot的结果，为了尽可能的保证目的蛋白不受影响，通常实验者都会选用裂解缓冲液( RIPA或NP-40 ) 是常规选择，然而针对一些特殊的靶标，需要选择最合适的裂解缓冲液配方，同时添加复合蛋白酶抑制剂也能最大化减少蛋白降解，而一些特殊蛋白检测，如磷酸化蛋白加测过程中还需要注意添加磷酸酶抑制剂。最后为了得到最好的检测效果，强烈建议对样本在裂解时进行超声破碎以确保充分裂解。
■ 图2.不同裂解液对HIF-1-alpha条带结果的影响 ■
蛋白上样量''
大多数实验者在进行上样时不进行定量或是会选择固定的上样量（ 10μg到100μg的总蛋白之间），选择这个上样量通常没有科学依据，大多来自于实验室一些不成文的经验。这通常导致目标蛋白和内参蛋白出现过载上样。尤其对于内参蛋白，这通常会在各道之间产生均匀的条带密度，看到这个结果别高兴，这并不能说明样本之间的总蛋白上样量一致，反而表明是由于过度上样导致的膜饱和现象。为了减轻膜饱和的影响，应在正式实验前，通过预实验得到每种蛋白上样量与条带密度的标准曲线。并选择其线性部分作为最合适的蛋白上样量。
■ 图3.通过实验确定合适的蛋白上样量 ■
上样对照''
一个好的上样对照（“loading control”）是指在同一样本中与目标蛋白共表达，并在不同样本间一致表达的信号。tubulin、β-actin和GAPDH这类管家蛋白（Housekeeping Proteins，HKPs）常被用作为上样对照即内参，但在使用管家蛋白作为内参时要考虑以下三点潜在缺陷：
1.在不同实验条件下，管家蛋白的表达可能会收到影响，β-actin不适用于骨骼肌样本，缺氧和糖尿病这类的实验不能拿GAPDH作内参， GAPDH在缺血缺氧刺激下会高表达。
2.管家蛋白通常在样本中含量很高，每泳道上样量超过4μg时就可能会出现膜饱和（如前文所述）。相关条带的密度在各道之间都相似，这将使这些蛋白看起来具有“良好标准化对照”的“外观”。
3.使用管家蛋白进行数据标准化仅依赖于一个数据点，难以发现实验处理造成的不一致性。
为了避免管家蛋白这些带来的潜在缺陷，科学界现在建议使用总蛋白检测进行上样控制，总蛋白有以下优点：
1.总蛋白具有宽泛的动态范围
2.总蛋白与泳道上样量具有1:1的变化关系
3.表达量不受样品处理方法的影响
有多种染料可以用来成像和量化印迹膜上的转移蛋白，包括Ponceau S、Coomassie R-350、Amido Black、MemCode和Deep Purple等。然而，这些染料各有其问题，比如重现性差、动态范围有限，以及与印迹膜和免疫化学染色的兼容性问题，最近，一些厂商开始推广Stain-Free技术来检测总蛋白，其原理本质是免染胶中含有特殊的小分子染料，能够与蛋白质结合，在成像仪上用特定模式即可得到清晰的总蛋白质条带，有研究对比后发现其线性结果优于传统的管家蛋白（图4）。
■ 图4. Stain-Free总蛋白检测对比传统的管家蛋白。GAPDH出现了“膜饱和”现象，tubulin、β-actin尽管信号看起来是线性的，但无法真实反应蛋白上样量变化，而总蛋白检测与预期结果符合较好 ■
背景处理''
高背景是导致Western Blot数据出现变异或错误结果的一个常见原因。使用传统的密度测定分析方法，如框选条带及其背景进行体积分析时，由于背景灰度值未从框中减去，因此可能出现因背景导致的数据变异。此外，由于所选条带的框总是包含条带和相关背景的信号，这在本身低密度条带中更为明显。当使用高背景的非特异性抗体检测具有差异表达目标蛋白的样本时，这些因素结合可能导致数据出现高度变异。一个好的替代处理方法是使用是滚球算法，结合泳道分析工具来减去背景数据的影响。常见的Image Lab和 Image J软件均包含这两种工具，可以同时使用，以确保为每一泳道选择合适的条带宽度和背景控制（图5）
■ 图5.使用滚球算法+泳道分析工具来对背景数据进行校正 ■
数据处理''
得到条带得密度数据之后，许多实验新人面临的第一个难题就是不知道如何将原始数据处理成可发表结果。实际上Western Blot数据的分析可以通过类似于qPCR结果分析的方法来完成，通过计算相对的、标准化的蛋白质表达，如下步骤所述。
1.对于每一块膜，将每个泳道中目标蛋白（TP）减去背景后的密度乘以膜上第一泳道加载的对照样本的加载对照（LC）（无论是管家蛋白还是总道密度）并比上凝胶中其他通道。这将得出相对于加载对照的标准化密度（NDL）。对照样本通常是对照组所有样本的混合匀浆，分装到多个管中，以便在每快胶的第一通道中加载新鲜的对照样本。
2.通过将每个泳道的NDL除以第一泳道对照样本的NDL，计算每个生物学/技术重复的倍数差异（FD）（表2）。
■ 表2. 对密度测定数据的计算分析（*来自每块凝胶/印迹第一通道加载的对照样本的密度数据） ■
3.通过将上述步骤2中的FD导入到统计分析软件包中，如PRISM软件中，确定生物学重复的平均FD及相关P值（表3）。
■ 表3 密度数据的统计分析 ■
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