mIHC染色解锁组织/细胞微环境的高维密码，突破传统染色限制，精准解析细胞互作与分子共定位，单张切片实现5-10靶标同步可视化，突破传统免疫组化（IHC）的单色局限。本文梳理 mIHC染色的核心逻辑，从原理到实操步骤全解析，实验新手小白也能轻松搞定美轮美奂的mIHC染色。
mIHC利用酪酰胺信号放大(TSA)技术，荧光素标记酪酰胺（Tyramide）在二抗携带的HRP酶促作用下，生成活化荧光底物与靶标蛋白的酪氨酸共价结合，从而使靶标蛋白标记上特定的荧光。随后通过剥离洗去非共价结合的抗体，再重复操作换下一个指标的一抗搭配另一种Tyramide进行染色，如此往复可在同一张切片上实现双标三色（货号RS0036）到六标七色（货号RS0039）甚至更多指标同时分析。
应用范围广，适用于石蜡切片、冰冻切片、细胞样品。
摆脱传统免疫荧光对抗体种属来源的限制和束缚，不依赖于一抗种属来源。
具有高灵敏度的HRP多聚合物鼠兔通用二抗。
无需通风厨和传统的脱蜡修复缸，将传统二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化和抗原修复整合成一个溶液。
非特异位点封闭和内源性灭活整合成一个试剂。
DAIP与封片整合成了一个溶液。
有效的缩短了操作时间，简化了繁琐的操作步骤。
多种试剂一站式配齐，操作更方便快速、灵敏度更高。
1. 将石蜡玻片在 65℃烘烤至少45min。
2. 把切片置于修复盒中，加入试剂9A（货号RS0055）稀释好的1×工作液。修复盒置于含有沸腾蒸馏水的水浴锅中加热30min。
注意： 本修复液兼容微波法，水浴法，高压法等修复步骤。也可以使用实验室常用修复条件替换本步骤，不使用多合一修复液的，需要在步骤 1 后增加脱蜡水化等步骤，一抗供应商特别声明需要其他修复液条件的，请参考一抗供应商建议。
3. 将修复盒撤离加热源，自然冷却至室温。取出切片放入装有蒸馏水的烧杯中，再用蒸馏水浸洗 5-6 遍。
1. 将冰冻切片放置室温复温2~5min至冰霜融化。
2. 4%多聚甲醛室温固定10~15min，用 1xPBS 洗涤5min×3次。若样品在包埋前已做固定处理，建议省略此步骤。
3. 可选步骤：把切片置于修复盒中，加入剂 9A（货号RS0055）稀释好的1×工作液，置于含有沸腾蒸馏水的水浴锅中加热30min。或参照一抗供应商特别声明的条件进行修复。
4. 可选步骤：用 0.1-0.3% Triton X-100（试剂自备）室温通透破膜20 min（膜蛋白可省略此步骤）。1xPBS 洗涤2min×3次。
1、造模完成的贴壁细胞用1×PBS洗涤2~3次。
2、用4%多聚甲醛室温固定10~15min，用1x PBS 洗涤5min×3次。
3、用 0.1~0.3% Triton X-100（自备试剂）室温通透细胞 20min，用1x PBS洗涤 2min×3次。膜定位蛋白抗体结合胞外区域的靶点可省略此步骤。
将玻片沥干几秒钟，用滤纸把组织周围的水分擦掉后，滴加适量试剂B（货号RS0053）覆盖组织切面（通常50~100uL），室温孵育15 min，PBST 冲洗 2 min × 3 次。
将玻片沥干几秒钟，用滤纸把组织周围的水分擦掉后，用免疫组化笔将组织圈起来。
将稀释好的一抗工作液滴加到组织上，直至完全覆盖组织，室温或 37℃ 孵育 1~2 小时，或 4℃湿盒中过夜后37℃复温 30 min，PBST 冲洗2 min ×3 次。
将玻片沥干，用滤纸把组织周围的水分擦掉后，滴加试剂 C（货号RS0011）覆盖组织，室温孵育 30 min，PBST 冲洗 2 min × 3 次。
加入荧光染料试剂 D-594 工作液覆盖组织，10min后，PBST 冲洗 2 min × 3 次。
加入适量 37℃预热好的试剂 F(货号YS0124)覆盖组织，37℃放置 5-20min，甩干后无需洗涤再次滴加适量抗体剥离液覆盖组织37℃放置 5-20min，弃剥离液，PBST 洗三次，每次 5min。
重复步骤 3-6（孵育第二支一抗，中间荧光染料改为试剂 D-488）。如需做多指标染色，循环重复步骤3-6，并更换对应靶点的一抗和荧光染料。
滴一滴试剂 G（约 30-50ul）在组织切片上，盖上盖玻片，尽量避免气泡。
扫描或拍照。
操作过程中需保持载玻片组织的湿润，如出现干片情况，会导致非特异性的染色结果。
持续加热修复的过程中，只需中小火维持沸腾，切勿高火加热使脱蜡修复试剂剧烈沸腾溅出烧杯。
TSA 染色比常规的荧光显色、TMB 显色有更高的灵敏度，如果荧光强度过高，可以尝试加倍稀释一抗，或加倍稀释 Tyramide染料。
可通过常规染色或预实验确定指标的表达丰度，通常优先染色表达量最高的指标，最后染色表达量最低的指标。
525、555、594 标记在镜下为不同程度的红色，请使用专门成像仪器和分析软件区分光谱。
本试剂盒中的脱蜡抗原修复液适配绝大多数一抗，如遇染色效果不佳，可使用通用公开配方对切片进行脱蜡和抗原修复。
部分组织切片经多次操作易掉片，可把组织放入孔板中操作。
可以根据对应指标的表达情况按预实验结果调整荧光染料搭配和染色顺序。
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RS0011 |
HRP多聚合抗兔/鼠二抗 |
3mL 10mL 100mL |
YS0006 |
350标记 Tyramide |
2mL 5mL 10mL |
YS0007 |
488标记 Tyramide |
2mL 5mL 10mL |
YS0008 |
525标记Tyramide |
2mL 5mL 10mL |
YS0009 |
555标记Tyramide |
2mL 5mL 10mL |
YS0010 |
594标记Tyramide |
2mL 5mL 10mL |
YS0011 |
647标记Tyramide |
2mL 5mL 10mL |
YS0012 |
680标记Tyramide |
2mL 5mL 10mL |
YS0018 |
750标记Tyramide |
2mL 5mL 10mL |
YS0004 |
抗原修复液20X pH9.0 |
250mL |
YS0002 |
抗原修复液20X pH6.0 |
250mL |
YS0014 |
DAPI/封片二合一溶液(防淬灭） |
5mL |
YS0124 |
温和型抗体剥离液 |
30mL |
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RS0035 |
鼠兔三标四色荧光检测试剂盒 |
1mL 2mL 5mL |
RS0036 |
鼠兔双标三色荧光检测试剂盒 |
1mL 2mL 5mL |
RS0037 |
鼠兔四标五色荧光检测试剂盒 |
1mL 2mL 5mL |
RS0038 |
鼠兔五标六色荧光检测试剂盒 |
1mL 2mL 5mL |
RS0039 |
鼠兔六标七色荧光检测试剂盒 |
1mL 2mL 5mL |
RS0111 |
兔三标四色荧光检测试剂盒 |
1mL 2mL 5mL |
RS0112 |
兔双标三色荧光检测试剂盒 |
1mL 2mL 5mL |
RS0113 |
兔四标五色荧光检测试剂盒 |
1mL 2mL 5mL |
RS0114 |
兔五标六色荧光检测试剂盒 |
1mL 2mL 5mL |
RS0115 |
兔六标七色荧光检测试剂盒 |
1mL 2mL 5mL |
RS0116 |
鼠三标四色荧光检测试剂盒 |
1mL 2mL 5mL |
RS0117 |
鼠双标三色荧光检测试剂盒 |
1mL 2mL 5mL |
RS0118 |
鼠四标五色荧光检测试剂盒 |
1mL 2mL 5mL |
RS0119 |
鼠五标六色荧光检测试剂盒 |
1mL 2mL 5mL |
RS0120 |
鼠六标七色荧光检测试剂盒 |
1mL 2mL 5mL |
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