免疫荧光图片处理神器
Image J
上篇的定量WB教程中使用过Image J这款软件，有些小伙伴可能对它不是很熟悉。Image J是由美国国立卫生研究院（NIH）开发的基于java的免费开源软件，用于处理和分析图像。在生物及医学图像分析中起着非常重要的作用。
相较于大多数显微镜仪器厂商提供的配套软件，Image J的特点是基于Java环境，可以在MacOS、Windows、Linux甚至PDA操作系统上运行，而基于其开源开放社区环境，有为数众多的开发人员编写并提供了一个不断增长的短插件程序库，通过插件Image J可以实现许多特色功能，在熟练的使用者手中其功能堪比厂家昂贵的付费软件。当然免费是有代价的，Image J程序界面对于刚上手的使用者来说不算友好，且功能复杂、高级功能依赖插件，初学者需要一定的学习成本。
ImageJ 软件主界面及官网帮助文档
1.软件功能介绍
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1.1插件
ImageJ目前拥有400多个插件可以自由下载，它们为ImageJ扩展了海量功能，但它们的数量之多也可能让人感到不知所措。哪些是适合免疫荧光的处理呢？
好在已经有实验室整理并维护了大量显微镜应用相关的插件并整合为一个扩展包如MBF ImageJ与Fiji。（官网https://imagej.net/mbf/installing_imagej.html和https://imagej.net/software/fiji/）。以MBF ImageJ为例，Windows 用户可以直接下载安装程序。这包括一个安装所有所需文件的设置文件。非 Windows 用户必须先从 ImageJ 主页安装适当版本的 ImageJ，然后下载仅包含插件的 MBF_ImageJ.zip 文件（解压到用户的 ImageJ 文件夹中）。
MBF Image J官网
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1.2多文件格式支持
ImageJ 支持大量的标准图像文件格式，包括最近实现的 48 位彩色复合图像支持。通过安装插件，比如Bio-Formats（https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/5.8.2/index.html）, ImageJ 能够打开140多种专有图像格式(涵盖大部分主流仪器厂家的专有格式)。值得注意的是，不仅是图像数据被导入，Image J还会导入额外的元数据，包括有用的信息，如曝光设置和激光功率，还包括像素大小、采集速率和 Z 步进等基本设置——获取到与厂家配套软件一致的完整图像数据。
Image J使用Bio-Formats插件可以打开蔡司显微镜专有格式CZI，并能查看拍摄时的参数信息
2.应用实例
2.1Masson染色后处理
左侧为Masson染色原始图片，右侧为Image j处理后的图片
使用 Masson染色得到的心脏切片。原始图像可以被分割为三个区域（分别为白色背景、蓝色胶原蛋白和品红色非胶原蛋白区域）。使用Image J分割处理后的图像，每个对应区域对比更为明显，以便于可视化观察心肌纤维化。
2.2
表达内质网（ER）靶向绿色荧光蛋白（GFP；绿色）并用 Mito Tracker® Orange（红色）染色的酵母图像处理
(Ai) 原始数据的最大强度 z-投影，(Aii) 使用 ImageJ 进行迭代反卷积后（处理时间为 2 小时），以及 (Aiii) 在 Volocity 中进行迭代反卷积后（处理时间为 5 分钟）。比例尺，2.5 微米。(B) 使用 ImageJ 中的 TransfomJ 和 Object Counter 三维 (3-D) 插件，对 Volocity 反卷积数据中红色通道的线粒体体积进行了量化。线粒体体积计算为 12.0 微米³（在 Volocity 中使用相同阈值计算的体积为 12.1 微米³）。(Bi) 反卷积堆栈的中位截面（第 90 层）与 ImageJ 插件识别的对象边界叠加。(Bii) 沿 BI 中 y-y′ 线的轴向截面，显示青色的对象边界。(Biii) 识别对象边界堆栈的 z-投影求和。
同时，由于Image J源代码开源可修改，使其成为开发和实施荧光共振能量转移（FRET）图像分析的首选。有多种插件可执行 FRET 图像序列的敏化发射和受体光漂白分析。
Image J FRET and Colocalization Analyzer 插件可用于FRET分析
3.自动化
ImageJ的内置宏编程语言是一种简单的基于文本的脚本语言，它可以用于自动化多个处理和分析步骤以及批量处理乃至非常复杂的例程。初次尝试编写宏时，可以使用宏录制功能轻松录制用户想要自动化的菜单命令。然后，这个初始宏可以进一步使用宏编程语言进行修改。
互联网上提供许多基于Image J宏的图像批处理教程，可以满足大部分实验数据分析自动化需求，感兴趣的小伙伴可以自行搜索相关教程。
B站上大量的Image J自动化相关教程
总 结
Image J 对科研者来说是一个强大的工具，它可以满足了大部分常规图像处理和分析的需求，允许使用者轻松处理不同厂家设备生成的图像和元数据，同时Image J还拥有大量的第三方插件及丰富详尽的教程，这些优势对所有使用显微镜拍摄荧光图像的实验室及科研人员都是无价的——不仅仅是那些预算有限的实验室。
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