抗体作为生命科学必备的实验工具，能够特异性识别并中和病原体、毒素和其他有害物质。因此，抗体在医学、生物学、化学和农业等领域都具有广泛的应用。毫无疑问，如果没有数百万种研究抗体产品可用，今天的生命科学研究将看起来截然不同。
大家在使用抗体进行实验闲暇之余，是否曾想过购买的抗体产品产生的结果是否可靠？以及自己手上的抗体是如何被生产出来的？其实抗体生产过程十分复杂，同时抗体生产技术也经过多次的迭代更新，就让小编带领大家一探抗体生产背后的秘密吧。
INGREDIENTS
抗体不同生产方式比较
传统的抗体生产方法极大地依赖于动物。用于抗体生产的动物们会接受免疫—被注射抗原和佐剂，激发体内抗体的产生—然后从腹水/血清中分离目标抗体（多克隆抗体），或从脾脏中提取淋巴B细胞，与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，进而从中提取出目标抗体, (单克隆抗体)。而近些年一些抗体生产厂商，将抗体基因克隆到高产率表达载体中并将这些载体引入宿主，从而获得重组抗体，重组抗体最大的特点是其克服了传统多克隆抗体和单克隆抗体批间一致性问题。
表 1. 多克隆抗体、单克隆抗体与重组抗体的生产方式与可重复性比较。
TWO MAJOR PROBLEMS
抗体生产两大难题：
可重复性与无动物成分生产
多克隆抗体源于免疫动物血清，而其中只有 0.5-5% 的免疫球蛋白能与其预期的靶标结合，这是因为多克隆血清由供体动物所有免疫反应产生的抗体混合物组成，其中产生的部分反应可能与所需抗原的免疫无关。并且，这种组成会因批次而异，因为每只动物的免疫反应都不同 ，即使同一只动物在不同时间采集的血液样本之间也会存在差异，这些未知的反应特性是无法控制，抗体生产厂商也无法去做详细的验证，导致多克隆抗体成为了一种成分不明确的试剂。
有一些抗体生产厂商尝试在抗体的生产过程中使用了诸如抗原亲和层析等方法以尽可能的纯化多克隆抗体，尽管采取了这些改进特异性的方法，多克隆抗体自身的缺陷导致了许多错误的科学结论产生。
使用特征不明确的抗体试剂则可能会导致了虚假或误导性结果的发表，《自然》杂志对 1,576 名研究人员进行的一项调查显示，70% 以上的研究人员无法重复其他科学家的实验1。科研人员很多时候工作是在先前研究的基础上进行，这种不可重复性会导致巨量的时间和资金被浪费；Andrew Bradbury 在 2015 年发表的论文中预计，全球在表征不良的抗体上花费的费用达 16 亿美元2。但是，自这篇论文撰写至今，这一预计数字增长了不止一倍，达到 35 亿美元3。例如有15 篇关于阿尔兹海默症相关蛋白 C9ORF72 的论文引用了一篇关于C9ORF72 抗体的研究，该研究后续被证实其使用的C9ORF72抗体无法特异性识别C9ORF72蛋白，所有的这些论文后续产生了 3500 次一级引用和 66000 次二级引用4。
图 1：Andrew Bradbury 在 abcam 可重复性科学周上谈论蛋白结合试剂花费的资金
那传统的单克隆抗体呢？虽然使用杂交瘤可以生成相同的单克隆抗体，但经过一段时间过后，它们会发生基因漂变，导致抗体批次随着时间的推移而发生细微变化；有研究证实，40% 的杂交瘤单克隆抗体会表达其他的生产性重链或轻链，因此不具备特异性5。同时在抗体长期生产过程中，这些杂交瘤细胞系也会面临被污染或是培养条件改变导致细胞衰老、活力下降最后导致整个批次无法使用等问题，这也是为什么我们会发现厂商有时会突然下架某些经典的单克隆抗体产品的原因。
同时不管是传统的多克隆抗体还是单克隆抗体生产都无法离开大量的直接动物使用，生产多克隆抗体需要将抗原注入实验动物体内。这会使实验动物不得不忍受极大痛苦，而单克隆抗体从宿主免疫到杂交瘤细胞制备也均涉及动物直接使用。
和其他的动物实验一样，多克隆抗体的生产需要接受所在机构伦理委员会的监督。一部分生产公司并不注重相关实验动物的福利问题。比如在2016年，美国最大的多克隆抗体生产商圣克鲁兹生物技术（Santa Cruz Biotech）公司就因为在生产多克隆抗体时涉嫌虐待山羊而被联邦政府处以350万美金的罚款，并被判不得再进行多克隆抗体的生产。Santa被巨额罚款的事件也因此让更多的抗体生产厂商考虑到使用动物生产抗体所带来的政策与法律风险。
IDEAL APPROACH
重组抗体：
解决上述问题的理想方法
一方面使用重复性不佳的抗体试剂导致了虚假或误导性结果的发表，另一方面使用实验动物生产研究抗体也受到批评。令人惊讶的是，这两个问题都可以用抗体重组生产技术解决。
由于重组抗体的序列已知，所以它们始终属于成分明确的试剂，这与厂商提供的绝大多数传统单克隆和多克隆抗体形成鲜明对比。因此，重组抗体可以提高研究的可重复性，因为只要知道序列信息，厂商就可以一直稳定的提供它们 - 这与维持液氮罐中的杂交瘤所需的努力相比，具有明显的优势。许多使用单克隆抗体进行的实验无法重复，因为杂交瘤克隆不再可用。相比之下，厂商通过已经建立了收集抗体序列的数据库，生产的重组抗体进行实验则会有无限重复性。同时重组生产也可以最大化避免使用动物来源成分，理论上可做到“无动物生产”，我们将在下期内容继续探讨这个话题。
参考引文：
1. Baker, M. 1,500 scientists lift the lid on reproducibility. Nature 533, 452-454 (2016)
2. Bradbury, A. & Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature 518, 27-29 (2015)
3. Freedman, L., Cockburn, I. & Simcoe, T. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology 13, e1002165 (2015)
4. Laflamme, Carl et al. Implementation of an antibody characterization procedure and application to the major ALS/FTD disease gene C9ORF72. eLife vol. 8 e48363. 15 Oct. 2019
5. Bradbury, A. et al. When monoclonal antibodies are not monospecific: Hybridomas frequently express additional functional variable regions. mAbs 10, 539-546 (2018)
6. 重组抗体的可重复性：白皮书, Abcam,
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