关于DNA提取的几种方法
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DNA提取的基本原理
DNA的提取可以简单的分为裂解和纯化两大步骤。
裂解是破坏样品细胞结构,从而使样品中的DNA游离在裂解体系中的过程;
纯化则是使DNA与裂解体系中的其它成分,如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。
提取步骤一 裂 解
常规的裂解液都含有去污剂(如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20等)和盐(如Tris、EDTA、NaCl等)。
去污剂的作用:
1) 使蛋白质变性;
2) 破坏膜结构;
3) 去除与核酸相互作用的蛋白质。
盐的作用:
1) 提供合适的裂解环境,如Tris;
2) 抑制核酸酶对核酸的降解,如EDTA;
3) 维持核酸结构稳定,如NaCl。
裂解体系中还可能加入蛋白酶,利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段,促进DNA与蛋白质的分离,同时,也便于后续的纯化操作。
提取步骤二 纯 化
1.酚氯仿抽提法:
主要是利用酚氯仿对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质,实现DNA与蛋白质的分离;再用醇将DNA沉淀下来,实现核酸与盐的分离。
酚氯仿抽提是去除蛋白质的有效手段,但如果蛋白质含量超过了其饱和度,裂解体系中的蛋白质就不会被一次性去除,需要进行多次反复抽提,而每次的抽提均会导致核酸的损失。酚氯仿抽提最大的优势是成本低廉,对实验条件要求较低。
2.高盐沉淀法:
高盐沉淀法是酚氯仿抽提方法的一个变种,其省略了酚氯仿抽提操作的麻烦,并且克服了酚氯仿抽提方法的缺点,只是得到DNA的纯度不够稳定。
3.离心柱纯化法:
原理是样品裂解后,DNA在高盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗、离心的步骤,将细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯化的DNA从硅基质膜上洗脱。
该方法利用某些固相介质,在某些特定的条件下,选择性地吸附核酸而不吸附蛋白质及盐的特点,实现核酸与蛋白质及盐的分离,是目前试剂盒提取广泛使用的方法。此外,该方法受人为操作因素影响小,提取DNA的纯度稳定性很高,其缺点是当样品过量时,需要反复进行离心,对样品的提取效率较低。
4.磁珠法:
将纯化介质包被在纳米级的磁珠表面,通过介质对DNA的吸附,在外加磁场的作用下使DNA附着于磁珠并定向移动,从而达到核酸与其它物质分离的目的。
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