WB自1979年提出，经过几十年的发展已经是一个应用十分广泛且成熟的实验方法。虽然实验方法相当成熟，但是课题涉及的靶点千千万，以及实验人一茬一茬换，因此总会遇到形形色色的问题。只要把握住WB的原理和流程，再多的问题也能归结到以下几类因素：样品表达以及制备环节，凝胶和电泳环节，转膜环节，抗体孵育环节，以及显色环节。
1、样品表达以及制备环节
WB是用来检测样品中靶标蛋白表达水平的，样品的质量直接关系到条带的呈现效果。
同一张膜不同泳道的条带数量呈现差异性，在上样量相同的前提下，可以考虑是否存在样品差异或不同处理条件下蛋白表达受调控；
若蛋白浓度较高或样品离子浓度较高，检测条带可能连城一条线。
当样品降解，检测可能出现凝而不实的发虚或拖尾严重的条带。
当然，也需要考虑靶蛋白本身是否存在糖基化修饰或泛素化修饰的情况。
因此，WB过程首先确认检测样品以及实验模型是否高表达靶标蛋白以及蛋白的特性；在提取蛋白时选择合适的裂解方式并加入适当的抑制剂，膜蛋白和核蛋白可以采用对应的试剂盒提取蛋白以提高样品质量，避免样品的反复冻融而导致的蛋白降解；根据蛋白丰度确认合适的上样量。
2、凝胶和电泳环节
电泳环节为蛋白分子提供场所，将样品中的蛋白分子按照分子量不同进行分类，如制胶或电泳出现问题，很难得到整齐划一的好看条带。
电泳槽漏液或线路老化导致凝胶电场不均匀，相同分子量的蛋白不在同一水平线。
上样力度不均匀，样品未充分混匀，或凝胶不充分，出现哑铃状条带。
凝胶不充分或者玻璃板未充分清洁，样品在电泳过程中迁移到泳道之外的区域。
凝胶储存不当或电源老化导致条带变形。
如电泳液不新鲜或配置试剂离子浓度不对，在电泳过程中产热较高会影响蛋白的稳定性和分离效果。
较低或较快的电泳速度都会影响蛋白的迁移速度和分辨率，对于不同分子量的蛋白应选用合适的分离胶浓度和电泳体系；注意配胶以及电泳液离子浓度和成分的正确量取，避免电泳液的多次重复使用和凝胶的储存不当导致的奇怪数据。
转膜是为了将凝胶中分离的蛋白分子转移到PVDF膜或NC膜上，以便蛋白分子与抗体进行特异性结合，从而实现对靶标蛋白的识别和分析。
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当转膜液有杂质或制备三明治时未充分赶走气泡，显色时会出现条带缺失或气泡印迹的情况。
三明治夹老化，海绵或滤纸使用时间过长，导致转膜三明治受力不均匀，出现局部转膜效果不佳的现象。
如果三明治夹的正负极放反，会出现阴性结果；通常可以通过膜上是否有预染marker条带以及立春红染色来判断转膜效果。
制备三明治夹进行转膜时，选择合适孔径的膜，注意夹子的海绵和滤纸厚度保持在微紧状态即可，太松条带会飘忽，太紧影响转膜效率；尤其需要注意正确对接三明治夹的正负极，并在冰浴条件进行转膜，同时需要注意电源的电压和电流是否匹配；。转膜效果可根据marker是否残留来判断，常规转膜液迁移效率大致是1kD/min，快速转膜液则根据说明书介绍使用。
膜上非特异位点的封闭，特异性抗体的选择以及抗体浓度和孵育时间是得到特异性条带的关键因素。
灵敏度高、特异性强、适用物种和应用广的优质抗体是WB成功的核心因素之一，Immunoway品牌重磅推出兔单克隆抗体、鼠单克隆抗体、纳米抗体靶点丰富，涵盖绝大多数信号通路。
化学发光和远红外荧光显色是应用较为广泛的两种显色系统。
WB过程中出现干膜的情况，或显色液孵育不均匀，曝光时会出现非特异的片状信号。
当膜上结合的抗体浓度过高而快速将发光液中底物耗尽时，显色会出现条带反白的情况，这与样品浓度和抗体浓度都有密切关系。
此外，显色时长是影响条带信号强弱和质量的重要因素。
在显色过程中，注意膜与发光液的充分且均匀的孵育，避免导致hrp失活的试剂接触膜或二抗，以免显色失败；低丰度蛋白可以使用超敏发光液提高显色效果。
更多的时候，WB条带的千奇百怪并不是单一因素造成的，而是多因素综合出现的结果，这就需要逐步排查寻找原因。
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