Western Blot做磷酸化蛋白太痛苦？试试Cell-Based ELISA！

磷酸化蛋白进行精准、高效的定量检测，是实验人员绕不开的核心挑战。 传统的Western Blot（WB）技术，因其流程的固有冗长性（包括样本裂解、电泳、转膜及多轮孵育），不仅严重制约了实验通量，更关键的是，不可逆的裂解过程使得脆弱的磷酸化信号极易发生降解或修饰丢失，严重影响了数据源的可靠性，而内参的标准化控制也常面临变异性。为了解决上述问题，Cell-Based ELISA技术应运而生。

Cell-Based ELISA

WB检测磷酸化蛋白的“经典困境”

对于每一位奋斗在生命科学前沿的研究者而言，Western Blot无疑是蛋白检测的经典技术。然而，当目标锁定在内源性，尤其是动态变化的磷酸化蛋白时，这条“经典之路”却布满了荆棘：

繁琐耗时： 从细胞收集、裂解、BCA定量，到上样、电泳、转膜、封闭、抗体孵育、显影……全套流程下来，耗费一整天甚至更长时间是家常便饭。

低通量： 一次能处理的样本数量有限，面对多浓度、多时间点、多药物筛选的大项目，WB显得力不从心。

半定量难题： 结果依赖灰度扫描，受内参蛋白表达稳定性影响巨大，难以实现真正精确的定量分析。

信号失真风险： 细胞一旦裂解，蛋白酶和磷酸酶被释放，极易导致目标蛋白降解或去磷酸化，无法捕捉到最真实的信号状态。

Cell-Based ELISA

新方法：Cell-Based ELISA

为了克服传统WB检测的上述问题， Cell-Based ELISA，一种基于2006年Nature Methods的一篇Quantification of Activated Signal Transduction Proteins Using FastActivated Cell-based ELISAs (FACE™)的革新方法，从根本上颠覆了传统流程。

它的核心工作原理极其巧妙：

• 原位培养与处理： 细胞直接在96孔板中培养，并接受药物或因子处理。

• 原位固定与通透： 无需裂解！直接在孔内对细胞进行固定和通透处理，将细胞内所有蛋白，包括其磷酸化修饰状态，“定格”在瞬间。

• 直接检测： 加入特异性一抗和酶标二抗，进行显色反应。

• 读板分析： 使用普通酶标仪读取数据，完成检测。

Cell-Based ELISA试验流程

Cell-Based ELISA

Cell-Based ELISA为何在磷酸化检测中更有优势？

无需细胞裂解，这是Cell-Based ELISA的“杀手锏”。它从源头上避免了裂解液中蛋白酶和磷酸酶对目标蛋白的降解和修饰，最大程度保留了蛋白质翻译后修饰（PTM）的原始状态。您检测到的，就是细胞在那个瞬间最真实的生理信号。

天然的96孔板形式，使其成为高通量筛选（HTS）的理想平台。无论是进行激酶抑制剂筛选，还是探索药物的剂量-效应或时间-效应关系，您都可以在一块板上轻松完成多浓度、多时间点、多药物的并行研究。

Cell-Based ELISA采用巧妙的“一孔双读”法进行归一化。在同一孔内，既能通过TMB显色读取磷酸化蛋白信号（OD450），又能通过结晶紫染色细胞核来精确反映孔内细胞总数（OD595）。通过计算比值（OD450/OD595），可以消除因细胞数量差异带来的误差，实现对单个细胞平均磷酸化水平的精确、可重复的定量。

一个孔内，同时检测目标蛋白信号（如蓝色）和细胞核（如紫色），最终通过两者的OD值比值进行精确定量

该方法对细胞量的需求远少于WB，对于珍贵、生长缓慢或原代细胞的检测尤为友好。

Cell-Based ELISA

实战案例 - 信号通路研究中的应用

Cell-Based ELISA已在众多高水平研究中展现其强大威力。

Title：Cholinergic stimulation blocks endothelial cell activation and leukocyte recruitment during inflammation.

数据A,B,C均是Cell-Based ELISA检测数据，轻松实现多种药物，多个浓度，多个指标的同时检测。使用ICAM-1 Immunoway货号KA4126C

Title：Differential chemoattractant response in adipocytes and macrophages to the action of acylation stimulating protein. 

数据A,B,C,D均是Cell-Based ELISA检测数据，多个时间条件的设置，摸索药物刺激最佳时间后，设置不同条件的处理检测。使用Immunoway Phospho-NFκB-p65 (S536) 货号： KA1122C及Phospho-NF-κB p65 (S468) 货号：KA1623C.

Cell-Based ELISA

全文总结

Cell-Based ELISA为蛋白磷酸化研究带来的价值是革命性的：省时、省力、省样本，结果更精确、更可靠。

Immunoway于2012年推出Cell Based Elisa，Immunoway的Cell Based Elisa产品目前涵盖2162多种信号通路及磷酸化产品指标，更多相关信息可官网搜索或联系我们！