当病原体攻击植物时，细胞内的钙离子会如同“警报信号”般迅速波动。如何精确捕捉这一转瞬即逝的动态？由中国科学院分子植物科学卓越创新中心王超团队开发的一项基于基因编码生物传感器的新技术，配合高通量检测平台，让研究者们实现了对植物活体钙信号的长时程、定量化监测。
在植物的生命周期中，时刻需要应对各种生物和非生物胁迫。植物没有神经系统，但它们有一套精密的“信号系统”来应对环境威胁。其中，细胞质钙离子([Ca2+]cyt)浓度的变化，是植物响应病原体攻击等逆境时最关键的早期信号之一。理解这一信号，对于解析植物免疫机制、开发抗病育种新策略至关重要。
从化学染料到基因编码传感器：植物活体钙离子信号检测技术的变革
早期，科学家使用化学荧光染料（如 Fura-2）检测钙离子，但这些染料难以进入活体植物细胞并靶向特定位置。随后，基于水母发光蛋白(Aequorin)的转基因技术实现了活体检测，但信号弱、需要外源性底物补充。21 世纪初，基因编码钙指示蛋白(GECIs)的出现成为植物活体钙离子检测的关键突破。其中，GCaMP3 将钙调蛋白(CaM)、M13 肽与 EGFR 耦合，当与钙离子结合时，荧光强度发生显著变化，从而实现对钙离子浓度的高灵敏度、非侵入式实时监测。
抗病小体：钙离子通道的“开关”
NLR 蛋白是植物细胞内免疫受体的核心组成部分，能直接或间接识别病原体分泌到植物细胞内的效应蛋白，根据其 N 端结构域的不同，可分为不同类型。其中一类 CC-NLRs（卷曲螺旋 NLRss）被激活后，聚合形成的“抗病小体(Resistosome)” 的 N 端 CC 结构域会形成漏斗状结构，这个结构能够直接插入质膜，形成钙离子通道，引发大量钙离子跨膜内流，从而激活下游防御反应，诱导细胞程序性死亡来限制病原体扩散。
新技术如何工作？
在本研究中，王超团队构建了稳定表达 GCaMP3 报告基因的烟草植株。当需要研究某个免疫受体（如小麦来源的 WAI3GOF）的功能时，便通过农杆菌将该受体的基因瞬时导入烟草叶片。
/ 实验步骤 /
1. 样品制备：
将携带相关构建物的农杆菌通过注射渗透法导入本氏烟草(Nicotiana benthamiana) 叶片中，该烟草表达胞质钙离子 ([Ca 2+]cyt)荧光报告蛋白 GCaMP3
渗透培养 5 h 后，使用打孔器取直径为 0.4 cm 的叶盘，转移至 96 孔黑色平底检测板（Corning）中，每孔预先加入 200 μL 蒸馏水
将叶盘在室温静置孵育 1 h，以消除取样过程诱导的[Ca 2+]cyt变化
2. 长时程动力学监测：
使用安捷伦 BioTek Synergy Neo2 多功能微孔板检测仪，以 2.5 min 的间隔持续检测 GCaMP3 的荧光信号（485 nm 激发， 516 nm 发射），动态监测 30 h
3. 数据分析：
使用 Gen5 计算 Normalized 原始数据后使用 R studio 绘图，反映胞内钙离子水平的动态轨迹
图 1 . 烟草植株叶盘取样及置入 96 孔板中用于高通量检测
关键发现：可视化“钙离子流”与免疫强度
研究通过对比空载体、已知阳性对照（ NRC4 突变体）和目标基因（ WA13 突变体），清晰揭示了不同免疫受体激活钙信号的独特模式：
WAI3GOF 能够使钙离子信号长时间、稳定地升高，表现为短暂的快速上升期和长时间的稳定期，表明 WAI3GOF 诱导钙信号过程在初始激活信号后存在正反馈调节。
NRC4DV 虽然也能够升高钙离子，但维持时间相对较短，表明 WAI3GOF 的作用更持久，反映这两个基因在本氏烟草叶片中的组装机制或蛋白质稳定性可能存在差异。
添加钙通道抑制剂 LaCl3 后，WAI3GOF 引起的钙内流被完全阻断，表明其作用依赖钙离子通道活性并且对 LaCl3 抑制敏感。
图 2. 采用表达钙离子报告蛋白 GCaMP3 的本氏烟草叶片进行 Ca2+ 动态时程分析。WAI3GOF 的表达诱导本氏烟草细胞持续且强烈的 Ca2+ 内流，该现象受到 2 mM LaCl3 抑制。分别以空载体 (EV) 和自激活突变体 NRC4DV 作为阴性与阳性对照
研究团队的其他实验结果还表明，WAI3GOF 引发的细胞死亡(HR) 也随着 LaCl3 的添加而消失，证明钙信号是细胞死亡的关键调控因素。
图 3. 野生型 RPS2 的表达在本氏烟草细胞中引发强烈的细胞质钙离子内流，使用 2 mM LaCl3 处理则可抑制这种内流。相反，RPS2 D2K/E17K/E23K 通道突变体无法引发钙离子内流
与WAI3GOF 引发的持续Ca2+ 急剧升高不同，破坏膜结合的 L12E/L15E 突变体或破坏通道 α1- 螺旋的酸性内层功能的突变体 D3K/E17K/D20K 基本无法显著提高细胞内钙水平，也不会引发过敏反应 (HR) 导致的细胞死亡，其进一步支持 WAI3GOF 在介导跨膜钙离子内流中的重要作用。此外， 除 WAI3 之外的 CCG10 家族NLRs，例如 RPS2，在激活后也会驱动较强的 Ca2+ 信号（见图 3）。这些发现表明，Ca2+ 信号是 NLR 免疫激活的核心枢纽，在多种免疫反应中均作为关键的第二信使发挥作用。
该方法的技术支撑：安捷伦 BioTek Synergy Neo2 全功能酶标仪
BioTek Synergy Neo2 全功能微孔板检测仪
/ Synergy Neo2 产品特点 /
1.顶部双平行PMT 检测器：
同时监测两种波长变化，通过比率型钙传感器可以消除非生理学变异带来的误差
2.滤光片光路为检测提供高灵敏度硬件基础
3.支持 96-1536 的高通量长时程检测与定量分析
本研究开发的检测方法的关键，在于将前沿的基因编码传感器与高性能检测平台相结合。这一技术将推动植物免疫研究从静态的“快照”分析，迈向动态的“生命信号电影”时代，为深入理解植物与环境互作的分子语言，并最终服务于智慧农业与分子育种，提供了强大的工具。
该方法不仅适用于研究 WA13，也已成功应用于其他 CC-NLRs（如 RPS2）的钙信号分析，证实了钙离子作为核心第二信使在植物免疫中的普遍性。为植物活体钙离子检测建立了一个标准化、定量化的平台。
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