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核酸凝胶电泳
01 凝胶电泳分离核酸的基本原理
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02 核酸凝胶电泳的主要步骤
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Basic Principles
图1.（A）核酸链携带的净负电荷。（B）凝胶电泳中不同长度的核酸片段分离。
该项技术主要在大小、电荷和结构的基础上，将电场施加于带电分子混合物上并引起迁移。中性至碱性pH值（图1 A）范围内，核酸中核苷酸骨架上的磷酸基团带负电。因此，每个核苷酸携带一个净负电荷，即一个核酸分子的总电荷与核苷酸的总数或它的质量成正比。换言之，DNA或RNA分子的荷质比是恒定的。因此，它们在凝胶电泳中的迁移率主要取决于其大小（结构可比较时）。因此，当受到电场作用时，核酸从负极向正极迁移，较短的碎片比较长的碎片移动得更快，导致基于尺寸的分离（图1 B）。
图2. 线性双链DNA片段大小和迁移的相关性。
此外，凝胶电泳中核酸的迁移距离通常与其大小具有可预测的相关性，从而能够计算给定样本中核酸的大小。对于线性双链DNA片段，在一定范围内，迁移距离与分子量的对数成反比（图2）。对于近似大小，迁移距离通常与已知大小分子的样品进行比较（分子量标准品，有时被称为“分子量标准”），该样品通常也参与凝胶电泳过程。
Main steps
图3. 核酸凝胶电泳的主要步骤。
1.选择和制备凝胶
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琼脂糖和聚丙烯酰胺是核酸分离中最常用的两种凝胶基质。两种材料都是三维基质，孔径大小适合核酸分离，且与样品间无反应。可通过改变基质的百分比来调整孔径大小，从而有效分离不同大小的核酸。
表1. 琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶之间的差异
2.准备标准品和样品
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在为给定样品选择合适的分子量标准时，需考虑如下因素:
a. 核酸类型（例如DNA或RNA），片段结构（例如单链或双链），构象（例如超螺旋、开环或线性）以确保对迁移进行适当比较
b. 片段的数量和适当的分离形式，用于大小的估计
c. 预期用途，如分子量标准是设计用于定性分析还是精确的定量测定
d. 不同类型凝胶适用的分子量标准（例如，部分预制凝胶推荐设计特定分子量标准以获得最佳运行结果）
e. 上样染料的性质，避免目的条带模糊
f. 上样缓冲液与使用凝胶的兼容性（例如，缓冲液的盐浓度会影响样品的迁移）
须计算上样到凝胶中的DNA量，以确保目的条带良好分离，并用于可视化和检测。虽然用荧光染料足以检测1-100 ng/条带的DNA，但最小可检测量取决于所用染料。样品或标准品的超载会造成条带污点并遮盖附近条带，从而导致条带分辨不清，特别是片段大小相似时。
3.运行电泳
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电泳缓冲液为具有缓冲能力的离子溶液，以保证电流流动同时防止pH值变化。理想情况下，电泳缓冲液和凝胶制备缓冲液应相同，以确保有效的导电性。核酸电泳中常用恒压，一般为5–10 V/cm。凝胶长度、所用电压和样品中的分子大小决定电泳所需的时间。通常，电泳会持续到目的条带迁移至凝胶长度的40-60%。
图4. 水平和垂直电泳系统的凝胶装置。箭头表示电泳中核酸迁移的方向。
4.在凝胶中可视化样品
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凝胶运行完成后，需对样品进行可视化分析。由于普通照明环境下，核酸不可见，因此需要一种可视化的检测方法。如表2所述，可用方法在样品检测中，提供了不同的灵敏度和增益范围。
表2.常见核酸凝胶染色和检测方法
5.记录凝胶
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如果样品被荧光染料染色，需特殊设备以适当的光源激发染料，使其显象并捕捉凝胶图像。激发光源在凝胶上，称为反射照明器（类似于手持式紫外线灯），或在凝胶下，称为透照器（图5）。由于反射照明器上的光源位置较远，所以样品收到的能量较少。这样可以减少紫外线对核酸的损害，但也会降低凝胶条带的信号。另一方面，透照器可为条带提供更高的信号，但由于辐射接近凝胶，会增加紫外线造成的伤害。
图5.反射照明器和透照器
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