组织切片因易于获取、性价比高，且样本中包含各类支持性细胞，能够保留组织的天然结构而备受关注。本技术概述介绍了使用 Seahorse XF Flex 分析仪和 Seahorse XF Flex 3D 捕获微孔板-L 分析肝脏组织代谢的优化工作流程。该工作流程专门用于检测 3D 样本的耗氧率 (OCR) 和细胞外酸化率 (ECAR)，能够对活组织模型进行实时代谢分析，并具有更高的灵敏度与稳定性。

实验部分

按照 Precisionary Instruments 的建议，将新鲜解剖的大鼠肝脏组织在冷却的含氧 Krebs-Henseleit 缓冲液中制备 150 μm 切片^[1]。使用 Ted Pella 活检工具打孔，制备直径为 1 至 2 mm 的圆形组织样本，并将其转移到含有安捷伦 Seahorse XF DMEM 检测液的 XF Flex 3D 捕获微孔板-L 中。向每个孔中插入捕获环,将组织样本固定在样品室内。使用移液器去除任何可见气泡。

在放置捕获环前后，分别使用 Agilent BioTek Cytation 1 细胞成像多功能微孔板检测系统以 4 倍放大倍率拍摄高对比度明场图像。使用这些图像评估每个圆形组织样本是否位于中心位置，并确认其尺寸。使用两次直径测量的平均值来计算圆形样本的面积。

使用安捷伦 Seahorse XF Flex 和 XFe24 分析仪采集基础 OCR 和 ECAR 测量值。XF Flex 仪器检测方案包括五个循环，每个循环包括：混合 3 分钟，等待 0 分钟，测量 3 分钟。XFe24 分析仪的仪器检测方案在混合与测量步骤之间需等待 2 分钟。每台分析仪使用的微孔板如表 1 所示。

完成基础代谢测量后，用 PBS 清洗组织，并用含有蛋白酶抑制剂的 RIPA 缓冲液进行裂解。经冻融和解离后，使用 Pierce BCA 检测试剂盒和 Agilent BioTek Synergy H1 Hybrid 多功能微孔板检测仪测定裂解液的蛋白质含量。

检测灵敏度和准确度

如图 2 所示，使用 XF Flex 分析仪和 3D 捕获板-L 采集的基础 OCR 数据更加稳定。该检测平台的数据显示，随着组织尺寸增加，OCR 明显增加，反映了出色的数据准确度。此外，XF Flex 平台的基础 ECAR 数据(图 3)不仅更加稳定，而且可以在该分析仪的推荐工作范围内(XF Flex 分析仪：>10 mpH/min)进行定量分析。相比之下，使用 XFe24 分析仪和胰岛捕获板获得的测量结果表现出较高的变异性，并且处于 XFe24 分析仪推荐工作范围的下限区间。XF Flex 分析仪和 3D 捕获板-显著提高了灵敏度和准确度，可以对组织样本进行全面的代谢评估。

重复性

除了改善 OCR 和 ECAR 信号之外，XF Flex 分析仪和 3D 捕获板-还能够显著减少变异性。图 4 表明，2 mm 圆形组织样本的基础 OCR 在各独立实验中具有高重复性。这一显著的性能提升意味着能够更好地检测实验组之间的差异，并且更可靠地表征组织代谢。

归一化

细胞能量代谢数据的归一化对于尽可能减少因细胞汇合度或样品前处理差异而导致的孔间变异性至关重要。在使用 XF Flex 分析仪的组织工作流程中，严格控制组织切片厚度和圆形组织样本直径是保持数据一致性的关键。此外，如图 5 所示，可以在放置捕获环之前采集明场图像以计算组织面积。鉴于 OCR 与组织面积之间的线性关系(图 6A)，基于组织面积进行 OCR 数据归一化可以进一步提高数据质量。图 6C 的归一化 OCR 数据表明，1.5 mm 和 2 mm 圆形组织样本的结果相当。

另一种选择是根据蛋白质含量进行数据归一化。虽然这种方法需要额外的样品处理步骤，例如制备裂解液和测定蛋白质，但根据组织类型的不同(细胞密度和异质性可能存在差异)，这种方法可能更为合适。对于高质量的 3D 代谢测量，可以对这两种归一化方法进行评估，然后选择合适的方法。

样品前处理优化

虽然 XF Flex 分析仪和 3D 捕获板-L 可以对 1 mm 圆形组织样本进行检测，但结果的变异性明显增加(图 6C)。为获得可靠数据，建议针对具体的目标模型优化组织前处理。我们假设 1 mm 圆形组织样本的结果变异性主要是由于各样本与位于孔中心的 XF Flex 分析仪探针板的距离不同造成的。图 5A 的右侧两列即为 1 mm 圆形组织样本，它们在各自样品室内的位置有显著差异。相反，左侧两列为 2 mm 圆形组织样本，它们与孔中心的探针之间的距离更加一致。