做实验时常常会怀疑人生：明明已经按照实验室祖传标准流程一步步操作，但仍不是每一次都能够得到理想的结果！难道实验室传承多年的protocol也有bug？
太过相信标准流程，说不定就忽视了实验中“亿些”可以优化的要点！
那么如何避免一条protocol走到黑？
Abcam打造全新内容板块，一期一篇专题内容，重点讲解热门应用WB, IHC在实际操作过程中如何避免 “刻板印象” ，让我们一起学习如何科学的根据靶标特性优化实验流程吧！
要知道不同定位的靶标蛋白会对实验条件的选择影响是巨大的！比如之前介绍过常规的煮样操作，竟然会导致膜蛋白条带拖尾、聚集、甚至无信号，还没看过文章的可以👉🏻戳这里
//话不多说，直接展示Abcam内部实验室结果，让我们来一起看看吧！
Western Blot
WB实验中检测核蛋白需特别注意
不同亚细胞定位的靶标蛋白适用的裂解液和裂解方法存在区别，如表1，建议参考产品说明书及文献报道，根据靶标及产品特性选择最合适的实验条件。
表1 不同样本及裂解缓冲液类型
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样品类型 |
裂解缓冲液 |
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全细胞 |
NP-40或RIPA |
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细胞质（可溶性） |
Tris-HCl |
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细胞质（细胞骨架） |
Tris-Triton |
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NP-40或RIPA |
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细胞核 |
RIPA或核裂解液 |
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线粒体 |
RIPA或线粒体分离方案 |
核蛋白检测时，强烈推荐对样本进行超声处理，超声破碎可以更好地破坏细胞核，提高核蛋白的提取效率。
当使用全细胞裂解液检测不到信号时，建议提取细胞核组分进行检测，该方法同样适用于膜蛋白，线粒体蛋白等特定组分表达的蛋白，同时，检测时注意带上特定组分的loading control以确保提取效率。
Immunohistochemistry
IHC实验中检测核蛋白需特别注意
若IHC检测核蛋白时出现细胞核无信号现象，可能是因为抗体不能穿透蛋白所定位的细胞核，此时可尝试向封闭缓冲液和抗体稀释液中加入强效通透剂（如 Triton™ X-100）；也可能是因为组织样本获取后，未及时处理，由于靶蛋白降解和细胞自溶等导致定位错误，此时建议更换新鲜处理的样本进行检测。
Immunocytochemistry
ICC实验中检测核蛋白需特别注意
对于细胞核蛋白优先尝试醛类固定，例如使用醛类（例如4%PFA）固定时，推荐室温固定10分钟。4%PFA固定细胞后，推荐使用0.1-0.25% Triton-X 100室温通透10分钟。通透处理能够在细胞质膜/核膜上打孔，使抗体能进入到细胞中和抗原发生结合，该步骤对于核蛋白的检测尤为关键。
ATF3靶点
WB检测ATF3时需要关注以下注意事项：
ATF3在部分细胞系中较容易观察到信号，比如293T；在部分细胞系中信号较弱或无信号，但刺激诱导后检测信号明显增强，比如Raw264.7，THP-1；在部分正常组织中较难检测到ATF3，比如肝脏、心脏组织，但有文献报道刺激后会增强组织中ATF3的表达。请注意不同细胞或组织的最适诱导方法可能存在区别，请根据文献或说明书选择合适的刺激诱导条件。
ATF3定位于细胞核，建议超声破碎处理细胞获得更多靶标蛋白，若全细胞裂解液检测信号仍然较弱，建议尝试提取细胞核组分增强检测信号。
ATF3实际检测分子量为21 kDa，请根据小分子蛋白实验建议进行操作。例如，在WB实验中使用15%或更高浓度的SDS-PAGE；转膜使用0.22μm的PVDF膜，并且转膜时间不要过长，防止信号丢失。
MDM2靶点
WB检测MDM2时需要关注以下注意事项：
MDM2存在明显存在表达特异性，在癌症组织中较容易检测得到，但在正常组织中低表达或不表达，可能会检测不到信号。
部分细胞系需要诱导刺激才能够检测到MDM2蛋白，请根据文献或说明书选择合适的刺激诱导条件。若不确定自己的样本是否表达靶标蛋白，强烈建议在实验中使用阳性对照（例如10uM Nutlin-3a处理24小时的2.4G2全细胞裂解液）。
MDM2定位于细胞核，建议超声破碎处理细胞获得更多靶标蛋白，若全细胞裂解液检测信号仍然较弱，建议尝试提取细胞核组分增强检测信号。
MDM2预测分子量为55 kDa，但由于存在多种异构体和翻译后修饰，以及p53激活时对MDM2的剪切作用，最终检测时观察到的分子量大小为90 kDa、60 kDa，所以可能观察到多条条带的情况，建议不要裁膜。
SOX2靶点
WB检测SOX2时需要关注以下注意事项：
SOX2在不同组织细胞中的表达不同，有些样本可能会出现弱表达或无表达的情况。请选择合适的实验样本，推荐使用阳性对照，例如NCCIT（人多能胚胎癌细胞系），以确认实验体系没有问题。
SOX2主要定位于细胞核，请选择合适的裂解方法来富集更多靶标蛋白。
IHC检测SOX2时需要关注以下注意事项：
SOX2在不同组织细胞中的表达不同，有些样本可能会出现弱表达或无表达的情况。请选择合适的实验样本，推荐使用阳性对照，例如人胶质细胞瘤，以确认实验体系没有问题。
ICC检测SOX2时需要关注以下注意事项：
SOX2主要定位于细胞核，对细胞进行通透处理尤为关键。如果用醛类（例如4%PFA）固定细胞，推荐使用0.1-0.25% Triton-X 100室温通透10分钟。
SOX2在不同组织细胞中的表达不同，有些样本可能会出现弱表达或无表达的情况。请选择合适的实验样本，推荐使用阳性对照，例如NCCIT（人多能胚胎癌细胞系），以确认实验体系没有问题。
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