科普 | 突破二维局限：3D细胞及类器官培养概述

传统的二维（2D）细胞培养，即细胞在平面上生长的方式，无法准确复制体内组织复杂的结构和微环境。这种局限性导致细胞行为、形态、基因表达和药物反应与活体生物存在显著差异。

针对2D培养的局限性，促使了三维细胞培养技术的问世，为科研工作者构建了更为逼真的体内细胞模型。细胞在三维培养下更贴近体内真实环境。例如，胶质母细胞瘤细胞在3D支架中培养时，其在细胞和细胞-细胞粘附、趋化因子和细胞因子信号传导、神经系统发育以及黏着斑通路中涉及的基因表达与2D单层培养相比显示出显著差异。其优势具体体现在以下几个方面：

1)微环境模拟：三维细胞模型能有效再现体内细胞微环境的复杂性，包括气体、营养物质及代谢产物等呈现的梯度浓度变化。

2)细胞间相互作用：该模型促进了细胞间的三维接触，实现了更为真实、直接或间接的细胞间通讯。

3)生理生化反应复现：在三维培养体系中，细胞对内外部刺激所产生的生化及生理响应，更符合其在生物体内的真实状态。

鉴于上述显著优势，三维细胞培养，特别是类器官（作为器官的微型3D版本，通过自我组织和分化形成3D细胞团块，重现其体内对应物的形态和功能）技术已在药物研发、干细胞培养与分化、以及组织器官再生等多个前沿研究领域展现出卓越的应用价值。

突破二维局限

基于支架3D培养方法

基于支架的3D细胞培养方法的示意

基于支架的3D细胞培养方法拥有悠久的发展历史，并得到了大量研究文献的充分佐证。在构建用于细胞培养的支架时，所采用的材料种类繁多，它们通常通过孔隙率、纤维结构、渗透性以及机械稳定性等方面来模拟天然细胞外基质（ECM）。这些支架能够有效再现体内环境中细胞间的复杂相互作用，以及细胞与细胞外基质间的精妙连接。同时，它们还为细胞提供了适宜的平台，支持细胞的聚集、增殖和迁移。在这类方法中，常见的支架材料包括水凝胶和Matrigel基质胶。

基质胶是一种溶解的基底膜制剂，提取自Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 小鼠肉瘤，这是一种富含细胞外基质（ECM）蛋白的肿瘤，其主要成分包括层粘连蛋白、IV 型胶原、巢蛋白等，还含有多种生长因子。它能模拟体内细胞外基质的结构和功能，为类器官提供三维支撑架构，让类器官在体外也能有 “家” 的感觉，从而维持其形态和功能。同时，基质胶中的生长因子等成分，能促进细胞增殖、分化，为类器官的生长发育提供营养支持，如同为类器官打造了一个充满养分的 “温床”

在类器官培养中，面对多种多样的基质胶，研究者需根据实验需求精心挑选。Matrigel 是最常用的基质胶之一，但因其含生长因子，若实验对生长因子敏感，就需考虑低生长因子含量的基质胶，可避免生长因子对实验的干扰。若要培养肿瘤类器官等对基质胶力学性能有特殊要求的类器官，可选择高浓度基质胶，更有利于肿瘤类器官的生长。丹望医疗自研低因子高浓度基质胶D23016-0010，其终浓度8-13mg/ml ，严格控制内毒素含量（≤4.5 EU/ml），可满足多种消化系统，泌尿系统等类器官生长需求，是一款具备高性价比的Matrigel产品，获得了业内深度认可。

水凝胶是高含水量的基质，提供类似组织的微环境，允许在3D中检测不同的细胞特性。它们使细胞能够像在活体生物中一样发育、运作并产生反馈。其机制涉及细胞被封装在水凝胶的多孔水合聚合物网络中或接种在其上。这个网络促进氧气、营养物质和废物的运输，使细胞能够在支架网络内增殖和迁移，并最终附着在其上。细胞与水凝胶的成分和机械特性相互作用，这些特性会影响基因表达并增强细胞-细胞通讯。

广义定义水凝胶可分为天然水凝胶和合成水凝胶，商品化的水凝胶产品多为合成水凝胶。

天然水凝胶： 例如胶原蛋白、纤维蛋白和Matrigel。它们提供天然的功能特性，但可能对温度或pH值过于敏感，并且来源于动物组织的基质可能含有不需要的成分、未定义的化合物，并存在批次间不一致的问题。

合成水凝胶： 由合成聚合物（例如聚苯乙烯、聚己内酯）或非聚合物支架（金属、陶瓷、生物玻璃）组成。它们提供更明确的分子结构和化学相互作用，为研究生物物理和生化特性提供了更可行和一致的平台。合成支架几乎可以完全控制机械特性和结构构造。

合成水凝胶在3D细胞培养中虽具有高可定制性、批次稳定及无动物源性等优势，但至今未能大规模替代Matrigel基质胶。这主要是因为它们难以完全复制Matrigel天然的生物复杂性，包括其多样化的细胞外基质成分和丰富的内源性生长因子，导致在模拟细胞的多维度信号识别与精细调控方面存在不足。此外，合成水凝胶在模拟天然基质的动态降解与重塑过程上仍有局限，且若要通过复杂修饰来提升其生物活性，往往会大幅增加成本与制备难度，使其在性能与经济性上难以全面超越天然基质胶。

水凝胶3D培养示意图

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无支架3D培养方法

无支架方法允许细胞在没有外部生物材料支架的情况下聚集并形成球状体或其他复杂的细胞结构。这些方法利用了细胞固有的自我组装和细胞-细胞粘附特性。

悬滴法是一种简单且经济的3D细胞培养模型，有助于形成多细胞球状体。它依赖于重力强制自组装。将少量细胞悬液滴倒置放置在培养皿盖或平坦表面上。重力和表面张力促进细胞在这些液滴内聚集并形成球状体。通过调整液滴体积和细胞密度，可以精确控制球状体的大小，从而实现均匀聚集体的可重复形成。

悬滴法培养示意

ULA培养板旨在最大程度地减少细胞与培养容器表面的粘附，即使在无支架培养基条件下，也能促进3D细胞培养物（如球状体）的自组装。

机制： 培养板涂有亲水性、中性带电的水凝胶层，该层共价结合到聚苯乙烯表面。这种水凝胶涂层有效抑制细胞的特异性和非特异性固定，并减少粘附蛋白和血清蛋白与基质的结合。通过阻止细胞粘附，细胞被迫处于悬浮状态，从而使其聚集成3D球状体。该涂层稳定、无细胞毒性、生物惰性且不可降解。

ULA超低吸附培养核心在于特殊的涂层处理（图示ibidi Bioinert处理）

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其他先进3D培养方法

芯片器官是微型微流控设备（比手掌还小），它们创建微通道和腔室用于细胞培养，其微环境类似于细胞的自然栖息地。它们结合了微制造和组织工程，以复制人体器官的关键生理环境和功能。

器官微流控芯片应用于临床

3D生物打印是一种先进的方法，通过逐层堆叠生物材料和细胞来创建定制的细胞结构设计，以形成复杂的组织和器官。其采用逐层方法来创建复杂的支架结构。这个过程允许合成生物相同的组织，可以顺利地整合到天然组织中。该技术对组织结构提供了无与伦比的空间控制，能够构建紧密模拟天然器官复杂性的复杂多细胞结构。它可以复制异质组织组成和血管网络。

3D生物打印将培养细胞和各种生物相容性材料相结合，可创造出生物墨水。随后可利用生物墨水形成功能组织用于药物筛选、疾病建模和体外移植。

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全文总结

3D细胞和类器官培养技术代表了生物医学研究的巨大飞跃，提供了生理相关模型，弥合了传统2D培养与复杂体内系统之间的差距。从水凝胶的可调生物物理线索和Matrigel固有的生物复杂性，到无支架球状体的简便性，以及芯片器官系统和3D生物打印提供的动态控制，每种方法都呈现出独特的机制、优势和应用。尽管在标准化、可扩展性和生物保真度方面仍存在挑战，但细胞生物学、材料科学和工程学交叉领域的持续进步有望彻底改变药物发现、疾病建模和再生医学，最终实现更具预测性的临床前研究和个性化治疗策略。