基于微孔板的均一化ROS检测分享
实验原理
H2DCFDA染色
细胞渗透性 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成H2DCF。而H2DCF不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的H2DCF生成有荧光的DCF (Ex/Em=488/525 nm)。
H2DCFDA染色原理
快速TCA-SRB染色
微孔板样品通过冷 TCA-SRB 同时固定和染色。在酸性条件下，SRB 与碱性氨基酸残基结合。经过洗涤步骤后，SRB 在碱性条件下溶解并释放到上清中，通过SRB信号可以反映了每个孔中细胞蛋白含量。
该方法适用于任何微孔板格式的贴壁细胞培养，并且可以由任何配备有带绿色和红色荧光通道（Ex 494/Em 522 和Ex 565/Em 586）的荧光模块的酶标仪进行检测（图 3）。快速 SRB 检测可用于标准化任何其他非破坏性基于细胞的检测读数。所有所需的试剂都可以非常容易地以较低成本获得。
TCA-SRB染色原理
实验步骤
1.实验流程
Protocol流程示意
2.实验步骤
A.布板
1.如果需要，用细胞外基质包被96孔板以适应所需的细胞类型。
2. 100 μl在不含酚红的完全培养基中以适当的密度过夜种植（通常为20,000-30,000细胞/平方厘米）,注意在室温（约24°C）下孵育最多0.5小时，以防止种植不均。
3.将孔板放置于二氧化碳培养箱加湿室内培养。
B.染料加载和孵育
1.实验当天，用预热的基础培养基（DMEM/F12，不含酚红）制备20 μM H2DCFDA。
2.移除培养基（如果细胞粘附性强，可以倒置并轻弹，否则请小心用多通道移液器移除培养基，对于悬浮细胞，在这一步之前先离心）。
3.使用多通道移液器向每个孔中加入100 μl 20 μM H2DCFDA。
4.将板放回培养箱孵育30分钟。
5.将板中内容物倒掉。
6.加入不含酚红的培养基和处理，包括过氧化氢作为阳性对照（例如，90 μl培养基，10 μl化合物）。
7.将板放回培养箱内的加湿室内，进行所需的处理时间（例如，1小时或24小时孵育）。
采集
1.使用适当的滤光片组（最接近Ex 494 nm/Em 522 nm）通过荧光酶标仪采集。
2.将板中内容物倒掉，加入35 μl冷TCA-SRB（0.004% w/v SRB在10% w/v TCA中）（2-8°C）在冰箱或冷室中孵育15分钟。将板中内容物倒进适当的腐蚀性废液容器，并用200 μl 1%醋酸洗涤。如果背景高于预期，孔板有液体残留时候，可能需要第二次洗涤。
3.将板中内容物倒掉，替换为100 μl 10 mM Trizma基础溶液，在环境温度下孵育5分钟，并在孵育后轻轻手动摇晃板5秒钟以重新分布染料。
4.使用适当的滤光片组（最接近Ex 565 nm/Em 586 nm）通过荧光酶标仪采集。
3.数据处理
导出数据为Excel。
1. DCF 和 SRB 数据中减去无细胞对照组的平均值（至少2重复）。
2. 计算相对于未处理对照组的 SRB 信号百分比。
3. 计算相对于未处理对照组的 DCF 信号百分比。
4. 计算每个孔的 DCF/SRB 百分比比率，以将 ROS 生成读数标准化为每个孔的细胞蛋白。
5. 统计分析包括独立 t 检验、单因素或双因素方差分析，并在多组比较时进行事后多重比较检验,如下图所示
相对 ROS生成结果示例：iPSC 衍生的星形胶质细胞用溶剂（0.2% DMSO）、100 µM 过氧化氢或蛋白酶体抑制剂 0.1 µM MG132 处理 24 小时。在处理条件下，通过细胞内 DCF 显微镜检测未能检测到 MG132 诱导的 ROS。图中展示了独立重复实验的平均值，并带有标准差误差条（n = 3）。显著差异通过单因素方差分析后采用事后 Holm-Sidak 检验确定。*p < 0.05。
注意事项
1. 样本至少包括 2 个技术重复、同时需要有空孔对照和阳性对照孔
2. 通常每个板需要大约 12 毫升的 20 µM H2DCFDA，6 毫升的 0.004% SRB + 10% TCA，22 毫升的 1% 醋酸和 12 毫升的 10 mM Trizma 缓冲液。
3. 阳性对照的 H2O2 浓度针对不同细胞应采用细胞毒性预实验来确定（理想情况下细胞死亡率 > 50%，但需要细胞不完全死亡），100 µM 对成纤维细胞和人类 iPSC 诱导的星形胶质细胞培养是合适的，但对不同的细胞则可能需要调整。
4. 对于批量处理板，可以将 TCA-SRB 步骤的 15 分钟持续时间替换为过夜，以减少孔间变异性。
5. H2DCFDA 的装载步骤可以变为在不洗涤的条件下与低浓度的 H2DCFDA（≤ 1 µM）孵育来替代，但必须考虑探针对特定细胞的毒性。
6. 不建议使用Hoechst 33342等DNA探针代替SRB进行均一化，原因是凋亡时细胞核会发生核碎裂现象，增加核酸探针结合，出现假阳性信号，如下图所示
细胞凋亡情况下Hochest荧光信号会出现假阳性信号
7. SRB染色可以结合其他DNA染料，进行综合评估，以便更准确的进行细胞数量或密度均一化对比。
使用SRB和LCS1染料合并均一化示例：（a）iPSC 衍生的星形胶质细胞按照 TCA-SRB固定并染色，（b）在SRB染色前使用 10 µM LCS1 染料染色。c）与相差显微镜图像叠加（（比例尺 = 100 µm）。
本文总结
本文分享的H2DCFDA结合SRB染色的方法提供了一种不同过流式进行定量ROS检测的方法，操作简单、实验成本低且可结合兼容其他均一化检测方法，对于有需求的实验者可以考虑使用该法批量检测ROS信号。
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