蛋白质与DNA的相互作用对于诸多重要细胞功能至关重要，如基因转录、DNA复制与重组、组蛋白修饰、损伤修复、染色体分离、染色体稳定性维持、细胞周期进程以及表观遗传沉默等。染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）是研究蛋白质与DNA相互作用的关键技术，能破译驱动发育、疾病、再生和进化过程中细胞身份的基因表达调控网络，也是大规模基因组学联盟绘制调控基因组的核心技术。
固定交联：固定细胞内蛋白与DNA的结合状态；
染色质片段化：超声法或酶切法使DNA断裂；
免疫沉淀：特异性抗体捕获目标蛋白-DNA复合物；
免疫沉淀DNA分析：PCR、qPCR分析特定基因或高通量测序进行全基因组分析（ChIP-seq）评估特定结合位点，以及其他检测手段。
交联是指通过甲醛固定，确保细胞内相互作用的蛋白质与DNA保持原始结合状态，避免在后续操作过程中发生解离。甲醛浓度、固定时间及反应温度对交联效果影响重大，这些参数因不同细胞或组织类型而异，开展实验前需要标准化这些参数。交联不足可能导致蛋白质-DNA相互作用在片段化过程中丢失，过度交联则会影响染色质剪切和细胞裂解效果。固定后应立即使用125 mM甘氨酸或终浓度1.5M的三羟甲基氨基甲烷（pH 8.0）终止反应。
细胞：
离心收集细胞，弃培养液，加入含有甲醛（终浓度1%）的基础培养基轻轻重悬细胞，37℃固定10min。
加入2M甘氨酸（终浓度0.125M）混匀后，室温静置5 min终止交联，3000 rpm 离心5 min弃废液。
预冷1× PBS清洗细胞2~3次，离心收集细胞。此时样品可用液氮速冻后，冻存于-80℃备用。
注意：细胞样品也可以在培养皿中固定并洗涤后，在培养皿中加入含有PIC的预冷1×PBS刮下细胞，3000 rpm 离心5 min，弃废液收集细胞。
组织：
将新鲜的组织样品洗净残血，剪切成2~3mm的小块，加入约10倍质量/体积比含有甲醛（终浓度1%）的PBS，室温固定15~30min。
加入2M甘氨酸（终浓度0.125M）来室温孵育10min终止交联。
低速离心弃上清，PBS洗涤2~3次弃废液。
02 裂解细胞&收集细胞核
该步骤的主要目标是分离细胞核，同时去除质膜和细胞质，裂解缓冲液应含有蛋白酶抑制剂，尽量减少蛋白质的降解，轻柔地吹打悬浮液，随后将离心管置于冰上4-5min，该过程可重复5-10次，以改善裂解效果。对于骨骼肌细胞/组织，进行更多循环操作裂解效果最佳。
细胞沉淀中加入预冷的SDS细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂，PIC），重悬细胞冰上放置10 min。
组织则转移至冰预冷的匀浆器，研磨数下以释放细胞核，转移至1.5 ml离心管中。
4℃、5000rpm离心5 min，吸弃上清。
加入超声破碎缓冲液重悬细胞核，放置于冰上。
03 染色质片段化
通常采用超声法（物理作用打破DNA共价键）或酶切法（如微球菌核酸酶MNase）对染色质进行片段化，150-1000bp的片段大小最适于免疫沉淀及下游检测，具体长度取决于实验类型，如ChIP-seq（150-250 bp）、ChIP-on-chip（150-400 bp）等。DNA 片段太大，影响 IP 效率已经ChIP的分辨率；DNA 片段太小虽然能得到更高的分辨率，但也会影响后续的 qPCR和建库。
冰上超声30s、停30s，循环5~30次。
4℃13000 rpm离心10 min，转移上清至1.5 ml管中，直接进行后续免疫沉淀试验，或冻存-80℃备用。
取50μL离心上清，加入缓冲液和适量5M NaCl（终浓度0.1M），65℃孵育4h解交联。
加入适量RNaseA，37℃，1h。
再加入适量Proteinase K，42℃，1h。
苯酚/氯仿抽提法纯化或试剂盒纯化DNA片段。
取2μL纯化DNA，100倍稀释，测定 OD260计算DNA浓度。
取2~5μL纯化DNA，1~2%琼脂糖胶电泳检测，观察大小分布和测量浓度。
注意：超/停时长需要根据具体超声仪功率进行调整。
04 免疫沉淀
在此步骤中，片段化后的上清样品与靶蛋白特异性抗体共同孵育，与磁珠结合捕获目的基因。多种因素可能影响免疫沉淀的效果，经验证适用CHIP的抗体是免疫沉淀成功的关键，此外，抗体使用量、磁珠或琼脂糖珠的选择、剪切染色质的片段大小与总量，以及孵育时间也至关重要。通常孵育时间为2-3小时或4°C低速旋转过夜，具体参考试剂盒说明书进行调整。
充分混匀重悬磁珠，取20μL磁珠于新的EP管中（2管），缓冲液洗涤3次，弃残液。
先取10μL片段化后的上清样品作为Input对照，冻存留待后续纯化DNA。
取10~30ug染色质、1~5ug靶标蛋白抗体，加入含有洗涤后磁珠的EP管中，缓冲体系100~200μL，4℃旋转过夜。
另1份磁珠EP管中加入等量染色质和同型对照抗体，作为阴性对照；也可以用组蛋白CHIP抗体再做1份阳性对照。
沉淀体系孵育过夜后弃上清，缓冲液洗涤磁珠与DNA复合物2~3次，弃上清。
加入50 μL洗脱液，将DNA复合物洗脱下来。
05 解交联、回收纯化DNA
完成免疫沉淀后，根据实验要求，可采用高盐、低盐、氯化锂或TE缓冲液等不同缓冲体系洗涤复合物（磁珠、抗体与染色质复合体），以最大限度降低非特异性结合。将洗脱缓冲液中的DNA-蛋白复合物于65°C孵育4-5小时，随后依次用RNase A和蛋白酶K在37-42°C处理各1小时解交联CHIP DNA，根据下游流程选择合适的方法纯化DNA。
洗脱后的上清转移于新EP管中，取出前面留存的Input对照。
加入缓冲液和适量5M NaCl（终浓度0.1M），轻轻混匀，65℃孵育4h。
加入适量RNaseA，37℃孵育1h。
再加入适量Proteinase K，42℃孵育1h。
苯酚/氯仿抽提法纯化或试剂盒纯化DNA片段。
06 下游DNA检测
根据实验需求和设计，可将纯化好的DNA片段用于下一步检测，如CHIP-qPCR、CHIP-seq。对于已经文献报道、或者有具体的研究靶标基因，可设计引物通过qPCR检测IP组基因富集倍数是否有明显增加，通常4倍以上的富集程度可初步认定CHIP结果阳性。未知基因结合位点，可通过高通量测序技术对DNA片段进行测序，筛选感兴趣的靶标基因。
蛋白-DNA交联程度至关重要，交联不足可能导致蛋白质-DNA相互作用在片段化过程中丢失，过度交联则会影响染色质剪切和细胞裂解效果。易捕获的蛋白如组蛋白、转录因子固定时间在10min左右，而辅助转录因子、DNA修饰酶可能需要固定20~30min。
抗体选择是ChIP成功与否的关键因素，优先选择已验证CHIP的抗体产品，或参考预实验效果选择适用抗体，每个反应体系抗体使用量在3~5ug。Imunoway重磅推出的兔重组基因工程抗体广泛适用于CHIP。
染色质片段化的超声条件因细胞类型以及超声仪功率和探头直径的差异化而不同，超/停时间间隔和循环次数都是片段化的核心因素。应优化程序：不同功率超声30s、停30s，分别进行5次/10次/20次/30次等超声并检测染色质片段化程度。
图为5.2 kb的DNA不同循环数超声后片段化效果
超声是通过物理作用力打断 DNA 的共价键从而将染色质片段化，也会对目的蛋白以及蛋白与DNA之间的相互作用产生不良影响。
设立合适的对照组是正确分析实验结果必不可少的环节，包括input、IgG（抗体同型对照）、IP（靶标蛋白抗体），以及可选做的阳性对照组，通常用组蛋白设定为阳性对照。
为确保实验的可重复性，实验中样品量、抗体浓度、反应体系、采用的缓冲液类型、孵育、洗涤、离心等条件应保持一致。
2×107个细胞用于CHIP实验，细胞裂解后的整个操作流程注意添加蛋白酶抑制剂，并在冰上操作以防止蛋白的分解。
100~200mg组织需要使用预冷的手术刀在干冰上切成1~3mm大小，组织太小会严重破坏细胞，太大则不利于后续处理。
使用组织样品做CHIP时，因个体样品差异可能导致染色质和蛋白含量存在偏差，可以加大每组样品量以及组织称重弥补这个因素。
每个ChIP反应体系大概需要10~30ug染色质，可以裂解细胞以检测蛋白浓度确保有足够的蛋白量进行下一步反应。由于不同靶蛋白的表达丰度差异较大，具体使用的蛋白量可做适当调整。
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