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Comprehensive analysis to identify DLEU2L/TAOK1 axis as a prognostic biomarker in hepatocellular carcinoma

PMID: 33575116    DOI: 10.1016/j.omtn.2020.12.016

肝癌，主要是肝细胞癌 (HCC)，是世界上第六大最常见的癌症类型和第四大癌症致死原因。据估计，2018 年，全球有782,000例死亡和841,000例新发肝癌病例。统计数据表明，HCC 的 5 年生存率为 18%，HCC的发病率和死亡率在许多国家仍在持续增加，被普遍认为是一种预后不良、生存率低的癌症。因此，必须探索有用的 HCC 预后生物标志物或治疗靶点，以改善我们在疾病诊断、预防和治疗方面的不足。

多项研究表明，lncRNA 在癌症生物学中具有直接和间接调节作用。这些长分子在各种癌症中经常失调，并且在不同类型的癌症（包括 HCC）中，特定lncRNA 与癌症复发、转移和预后不良相关。MicroRNAs (miRNAs) 是一种小的单链 ncRNA，可以与其靶标mRNA 的 3' 非翻译区 (UTR) 结合以抑制基因降解或翻译。miRNA 调控人类基因组中大约30%的基因。在细胞质中，Salmena等人 提出了竞争性内源 RNA (ceRNA) 假说，即lncRNA主要通过ceRNA调控机制来调控mRNA。

PTEN 是人类癌症中非常常见的突变抑癌基因，包括 HCC。越来越多的证据表明PTEN活性可以通过突变、表观遗传沉默、异常蛋白质、转录抑制、定位和翻译后修饰。一些数据表明PTEN表达降低是HCC中的常见事件，与疾病分期、肿瘤分级和大小以有关。

2.1  |  PTEN过表达在HCC中的抑癌作用和预后价值

为了研究PTEN在HCC中的作用，基于人类蛋白质图谱 (HPA) 数据库，发现PTEN在正常肝组织中过表达，但在HCC组织中下调（图2A）。从HPA获得的免疫组化 (IHC) 染色也证明了类似的PTEN表达失调（图2B）。根据Kaplan-Meier生存曲线，如图2C所示，PTEN与HCC患者的总生存率 (OS) 显着相关。此外，为了了解PTEN在HCC中异常低表达的潜在机制，分析了PTEN的基因组和拷贝数。OncoPrint图显示了TCGA HCC数据集中PTEN基因的缺失（图2D）。如图1E所示，超过三分之一的HCC样本具有PTEN缺失，并且具有PTEN缺失的HCC样本的 mRNA表达低于具有二倍体PTEN的样本。此外，在HCC样本中发现PTEN拷贝数值与mRNA表达之间呈正相关（图2F）。

总之，这些数据表明PTEN表达在HCC中下调，并且PTEN拷贝数的缺失可能是导致HCC患者PTEN下调的主要机制之一。

2.2  |  鉴定差异表达基因 (DEGs)（DEmRNAs、DElncRNAs 和 DEmiRNAs）

根据以上分析，与PTEN相关的ceRNA网络可作为HCC患者的潜在预后模型。为了验证这一猜想，首先使用TCGA数据库鉴定了具有PTENhigh和PTENlow表达组的HCC样本中以及HCC和邻近正常组织中的 DElncRNAs、DEmiRNAs 和 DEmRNAs。

总共从具有PTENhigh和PTENlow表达组的HCC样本中挑选出860个DElncRNA（137个上调、723个下调）、54个DEmiRNA（21个上调、33个下调）和 1,871个DEmRNA（195个上调、1676个下调）。

在HCC样本和正常肝组织样本之间共鉴定出3371个DElncRNA（3,041个上调、330个下调）、420个 DEmiRNA（102个上调、318个下调）和8294个 DEmRNA（7,059个上调、1235个下调）。火山图显示了PTENhigh和PTENlow表达组之间DElncRNA、DEmiRNA和DEmRNA的分布（图3A-3C），热图描绘了具有 PTENhigh 和 PTENlow 表达的HCC样本中15个显着的DEG（图3D-3F）。

2.3  |  lncRNA-miRNA-mRNA三重调控网络的构建

为了在HCC中建立lncRNA-miRNA-mRNA三重调控网络，在PTENhigh和PTENlow表达组以及HCC和正常肝组织组中进行了联合分析。首先，将DElncRNA放入TarBase数据库中，识别潜在的靶向miRNA。在与54个DEmiRNA进行交集后，从预测的miRNA中选出了4个。然后使用miRDB和TargetScan数据库来识别下游目标mRNA。结果显示，在8294个DEmRNA中鉴定了 373个mRNA。最后，包含5个lncRNA（4个上调和1个下调）、4个miRNA（1个上调和3个下调）和372个 mRNA（326个上调和46个下调）形成HCC相关的 lncRNA-miRNA-mRNA三重调控网络(图4A)。结果显示，3个lncRNA（DLEU2L、FAM99A和ARRDC1-AS1）、4个miRNA（miR-99a-5p、miR-100-5p、miR-9-5p和miR-125b-5p）和6个mRNA（ TAOK1、HS3ST3B1、RHOQ、AGO2、BAZ2A和NR6A1) 被确定（图4B）。

为了进一步探索与三重调控网络相关的潜在功能，进行了功能富集分析（GO和KEGG）。结果表明，参与网络的DEmRNA富集在“蛋白激酶活性”、“参与分化的细胞形态发生”和“GTPase 结合”（图4C）。

2.4  |  ceRNA网络的构建和验证以及具有HCC特异性预后价值的模型的选择

三个hub-DElncRNA、四个hub-DEmiRNA 和六个hub-DEmRNA在PTENhigh和PTENlow组的表达模式结果显示lncRNA：一个下调 (DLEU2L) 和两个未分化 (ARRDC1-AS1、FAM99A) ，miRNA：一个上调 (miR-9-5p) 和三个下调 (miR-99a-5p、miR-100-5p、miR-125b- 5p) ，mRNA：三个下调（TAOK1、HS3ST3B1、AGO2）和三个未分化（RHOQ、BAZ2A、NR6A1）（图 5A）。在HCC和邻近正常肝组织中发现lncRNA：两个上调（DLEU2L、ARRDC1-AS1) 和一个下调 (FAM99A) ，miRNA：一个上调 (miR-9-5p) 和三个下调（miR-99a-5p、miR-100-5p、miR-125b-5p），mRNA：五个上调（TAOK1、 RHOQ、AGO2、BAZ2A 和 NR6A1) 和一个下调 (HS3ST3B1)（图5B）。

然后，为了确定这些RNA是否与HCC预后相关，使用Kaplan-Meier分析和对数秩检对HCC患者进行OS分析。发现一种DElncRNA（DLEU2L）、两种DEmiRNA（miR-99a-5p 和 miR-100-5p）和三种DEmRNA（TAOK1、HS3ST3B1 和 RHOQ）与预后相关（图6).

考虑到lncRNA的细胞定位决定潜在机制，分析了三种 DElncRNA的亚细胞定位。如图7A所示，DLEU2L主要位于细胞质中，而另外两个lncRNA（FAM99A 和 ARRDC1-AS1）主要分布在胞质溶胶中。这些数据表明，DLEU2L可能通过海绵miR-99a-5p/miR-100-5p来提高TAOK1的表达。因此，构建了DLEU2L-miR-100-5p/miR-99a-5p-TAOK1 ceRNA网络（图7B）。图7C miR-99a-5p和miR-100-5p与DLEU2L和TAOK1 3'UTR 中靶位点之间的碱基配对。此外，表达相关性分析表明DLEU2L表达和TAOK1表达之间存在正相关关系（图7D）。因此，选择ceRNA网络中的DLEU2L/TAOK1轴作为下一步分析的潜在预后模型。

2.5  |  DLEU2L/TAOK1轴在HCC患者中的临床相关性

为了确定DLEU2L和TAOK1的表达水平是否受临床特征的影响，探讨了DLEU2L和TAOK1表达与临床因素的相关性。研究表明，DLEU2L和TAOK1表达水平均与肿瘤直径和肿瘤淋巴结转移（TNM）分期呈正相关，与年龄、性别、淋巴结转移、远处转移和BMI之间无关。

在DLEU2L和TAOK1的单变量Cox回归分析模型中，TNM 分期、肿瘤直径、淋巴结转移和远处转移与HCC患者的OS密切相关。DLEU2L和TAOK1过表达水平与较差的预后显着相关。在TAOK1的多变量Cox回归分析中，肿瘤直径、远处转移和TAOK1高表达仍然与OS相关。然而，DLEU2L的多变量Cox回归分析显示，升高的DLEU2L表达与不良预后无关。因此，TAOK1可能成为HCC患者的独立预后因素。

2.6  |  TAOK1异常高表达的验证

为了更好地理解DLEU2L/TAOK1轴在HCC中的作用，接下来详细分析了TAOK1。首先，基于在线工具癌症细胞系百科全书（CCLE），发现TAOK1在HCC细胞系中高表达。GEO数据库中的GSE41804 HCC队列显示TAOK1在HCC组织中的表达明显高于非肿瘤肝组织，这与TCGA 数据的结果一致（图5A和6）。然而，在HCC样本中没有观察到TAOK1表达和拷贝数值的显着关联。因此，TAOK1异常表达与HCC中的拷贝数改变之间没有相关性。

2.7  |  TAOK1甲基化与表达的关系

为了进一步阐明TAOK1在HCC中的异常上调机制，还探讨了TAOK1表达水平与其甲基化状态的相关性。首先，HCC TAOK1high和TAOK1low组之间三种DNA甲基转移酶（DNMT1、DNMT3A和DNMT3B）的差异表达分析表明，与TAOK1low组相比，TAOK1high组中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达显着增加（图8A） ）。UALCAN的分析表明，DNMT1在正常肝组织中的甲基化水平高于HCC组织（图8B）。同样，DiseaseMeth 2.0版分析表明，与HCC组织相比，癌旁正常组织中TAOK1的甲基化显着更高（图8C）。在TAOK1的DNA序列中发现了两个甲基化位点（cg16008158和cg2570978），它们与其表达水平呈负相关（图8D）。

2.8  |  HCC免疫浸润与TAOK1表达的相关性

为了评估TAOK1表达与HCC免疫浸润水平之间的潜在关系，进行了以下分析。首先，“SCNA”模块分析表明，几种免疫细胞浸润水平似乎与TAOK1基因拷贝数的改变有关，包括 B细胞、CD4+ T细胞、巨噬细胞和树突细胞 (DC)（图9A）。然后，“基因”模块分析显示TAOK1表达与肿瘤纯度没有显着相关性，但与HCC中 CD4+ T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润水平显着正相关（图9B）。最后，我们进一步评估了免疫浸润对HCC患者临床预后的影响。结果表明，高水平的CD4+细胞、巨噬细胞和中性粒细胞与生存期小于24个月的HCC患者的预后不良相关。这些结果表明DLEU2L/TAOK1轴可能通过调节肿瘤浸润免疫细胞的水平来影响HCC和临床预后。

2.9  |  HCC中TAOK1相关功能富集分析

为了进一步研究TAOK1在HCC中的功能，利用GO和KEGG通路富集分析了TAOK1在HCC中的前200个相关基因。与TAOK1相关的富集项是MAPK信号通路。与TAOK1相关的GO富集分析，包括生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF），主要有“有丝分裂细胞周期相变”、“组蛋白修饰”和“激酶活性” 。”

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