分享一篇2022年1月3日发表在Molecular Cancer文章《Identification of tumor tissue-derived DNA methylation biomarkers for the detection and therapy response evaluation of metastatic castration resistant prostate cancer in liquid biopsies》IF：27.401 。
前列腺癌（PCa）是全球男性最常见的癌症之一，它是一个高度异质性的疾病，范围从惰性局部癌症到侵袭性高危阶段，包括转移性激素敏感或激素难治性前列腺癌。在这项研究中，我们研究了基于DNA甲基化的生物标志物对非侵入性PCa诊断的适用性。基于实验和生物信息学分析，我们确定了两个DNA甲基化特征，它们可以作为液体活检中检测甲基化ctDNA的最小入侵性标记物。这些特征允许以高特异性和敏感性对MCRPC进行分类，并能够区分不同治疗方式后的反应者和非反应者。重要的是，几个单独的标记基因对放射学无进展生存期具有预后潜力，不受其他临床变量影响。
背景
前列腺癌 (PCa) 由于目前的生物标志物的特异性和敏感性的限制，迫切需要更好的生物标志物，能够可靠地区分良性和恶性前列腺疾病、定位性和转移性以及侵袭性和惰性疾病。PCa的治疗方案大多基于非靶向治疗，包括根治性前列腺切除术、使用雄激素剥夺疗法（ADT）的激素治疗、雄激素受体（AR）信号靶向药物、化疗或放疗，取决于疾病状态和风险分类。尽管对ADT有良好的初始反应，但肿瘤最终会发展为转移性PCa（mCRPC）。在这种情况下，最近的治疗方法包括针对DNA修复基因突变的肿瘤的聚（ADP-核糖）聚合酶抑制剂（PARPi），或针对PSMA阳性的癌症使用177Lu-PSMA的放射性核素治疗，都显示出良好的效果。液体活检检测，分析血浆或其他体液中的循环游离肿瘤DNA（ctDNA）或循环肿瘤细胞（CTCs）已被证明是生物标志物的有用来源，并已进入临床用于辅助诊断。除了基因改变之外，包括DNA甲基化在内的肿瘤表观遗传变化在ctDNA和CTCs中也是可以测量的，它们作为诊断性、预后性和预测性表观遗传生物标志物的潜力已经在大量的研究中得到证实，但目前只有少数人进入临床实践。
结果
组织特异性DNA甲基化标志物的鉴定
一些研究显示，正常组织和PCa组织之间的DNA甲基化特征的差异揭示了潜在的基于DNA甲基化的PCa检测生物标志物。为了定义合适的非侵入性诊断的表观遗传标记，我们结合实验和高通量数据得出92个甲基化标记，这些标记在肿瘤和正常邻近组织之间有明显的甲基化差异，随后我们对PCa患者的ctDNA进行了测试（图1A）。
图1A
首先，我们使用Infinium HumanMethylation450 BeadChip阵列，对从6个局部PCa组织中分离出来的DNA与6个相邻的正常组织进行检测。从这些分析中，发现7个基因，包括SERPINB1、ACSS3、SCGB3A1、NKX2-6、HOXA7、CRABP2和DHRS4L2在肿瘤样本中与邻近的正常组织相比明显高甲基化。这些基因的甲基化水平从良性肿瘤到PCa再到转移性肿瘤持续上升，正如两个已发表的数据集所分析的。沿着这些思路，我们可以确认在公开的癌症基因组图谱PCa数据集TCGA-PRAD中，所有7个标记物的肿瘤特异性高甲基化具有高度意义。此外，我们从TCGA-PRAD的甲基化数据中推断出85个甲基化标记，包括PCa（n=498）和邻近的正常组织（n=54）。我们选择了合适的区域进行标记评估，这些区域至少包含三个相邻的CpG位点，这些位点有明显的甲基化差异（P<0.05），在对照组中显示低甲基化（低于20%），并且对照组和肿瘤的甲基化差异至少为15%。在总共92个候选区域中，有80个位于相应基因的启动子区域（转录起始位点的上游-1500bp到下游+1000bp），80个中有65个位于CpG岛中。其余12个候选区域位于基因间区域或基因体中。
确定患者液体活检中转移性阉割抗性前列腺癌的甲基化分类器
为了测试92个确定的甲基化标记物是否适合检测患者血浆样本中PCa特异性的ctDNA甲基化，我们采用了高通量甲基化敏感限制酶（MSRE）检测方法。这种方法是基于对未甲基化DNA的选择性消化，可以应用于多重环境中，检测低至10个拷贝的DNA数量和未甲基化背景中0.1-1%的甲基化DNA。
首先，我们总共分析了174份血浆样本，包括良性疾病患者（n=48）、局部PCa（n=65）和mCRPC（n=61）。由于MSRE-qPCR表现不佳，良性队列中的一个样本被从进一步分析中删除。相对甲基化值是根据甲基化比例（PMR）计算的，其中样本对输入DNA和两个表明100%甲基化的对照检测进行了归一化处理。无监督聚类显示大多数mCRPC血浆样本的甲基化水平很高，而正常和局部PCa血浆样本的甲基化值很低，与PBMC对照组聚在一起（图1B）。
图1B
接下来，92个分析过的候选标记物被用于预测模型的计算，为基于不同算法的类预测模型输入PMR值，包括对角线判别分析（DLDA）、最近中心点预测器、k-近邻预测器、支持向量机和（贝叶斯）复合协变量预测器（BCCP/CCP）。我们使用了p≤0.01的临界值和10倍交叉验证法。当比较良性样本组和MCRPC样本组时，92个标记中的83个被计算出来，根据所使用的预测模型，可将93%至96%的样本准确分类到正确的组别中。曲线下的面积（AUC）也取决于所使用的模型，显示出0.968（CCP）、0.972（DLDA）和0.966（BCCP）的数值。同样地，将局部PCa与MCRPC队列相比较，在测试的92个候选标记中，有83个将87%至96%的样本归入正确组别，AUCs为0.956（CCP）、0.958（DLDA）和0.949（BCCP）。虽然一般情况下无法推断出良性与局部PCa的准确预测模型，但在良性样本与Gleason Score为9或以上的PCa之间进行比较，结果AUC为0.828（CCP）、0.794（DLDA）和0.8（BCCP），92个分析的标记基因中有12个的正确分类率为79%至89%。尽管我们也观察到与良性和局部PCa样本相比，mCRPC样本中的cfDNA明显增加，但检测不到DNA甲基化和整体cfDNA浓度的相关性。此外，在ROC分析中，DNA甲基化的表现优于整体cfDNA浓度的测量
为了确定一套最小的标记，以便准确检测mCRPC，我们使用递归特征消除法进行了签名分类器计算。这导致了一组包括CHST11、CUGBP2和PCDHGC4在内的三个候选标志物，它们可以准确地将mCRPC与局部PCa和良性患者的组合组区分开来（图1C）。根据所使用的预测模型，该基因特征将92%至95%的样本归入正确组别，AUC为0.963（CCP）、0.978（DLDA）和0.953（BCCP）（图1D）。个别基因显示AUC为0.982（CHST11）、0.632（CUGBP2）和0.906（PCDHGC4）。些数据共同表明，根据甲基化特征可以高度准确地识别mCRPC，而Gleason评分低于9分的器官局限性PCa则无法与良性样本区分开来，这很可能是由于ctDNA的数量有限，这在其他使用数字液滴PCR分析局部PCa患者的DNA甲基化的研究中也有描述。一般来说，ctDNA与正常细胞脱落的cfDNA相比，显示出较小的片段大小。当对良性、局部PCa和mCRPC血浆样本的子集进行片段分析时（每组n=20），我们观察到平均cfDNA片段大小从良性和局部PCa的175bp（范围168-183bp）到mCRPC的168bp（范围145-179bp）样本的显著转变。
图1C和图1D
DNA甲基化标记物对无进展生存的预后潜力
为了测试我们的甲基化标志物是否能预测临床结果，如放射学无进展生存期（rPFS），我们利用治疗后血浆中候选基因的甲基化水平进行生存统计。Kaplan-Meier生存分析显示，包括三个特征基因（AKR1B1、KLF8、LDAH）在内的几个候选标记物的甲基化与rPFS下降有明显的关联（图1H）。
图1H.
接下来，我们进行了单变量和共变量的考克斯回归分析，以确定我们的标记物对总生存期（OS）和rPFS的预后价值。对于OS，在单变量分析中，CRABP2和TNFAIP8的甲基化是治疗后患者血浆中重要的预后因素（HR为4.013和0.036；P值为0.0395和0.0191），但在包括治疗或PSA水平为变量的共变数模型中并没有保持显著性（表1）。对于rPFS，在单变量cox回归分析中，23个单独的标记基因的甲基化是疾病复发的负面预后因素，危险比（HR）从2.829（HOCX4,5,6，p = 0.04）到12.56（CRABP2，p = 0.002）。由于大多数反应者患者接受了醋酸阿比特龙治疗，因此进行了协变量考克斯回归。尽管醋酸阿比特龙治疗显示出对放射学复发的显著预测价值（HR 0.2337，p = 0.0067），但15个候选标记物的甲基化仍然是一个独立的重要预测因素，HR从3.2（PROM1，p = 0.04）到7.968（CHST11，p = 0.0004）（表1）。值得注意的是，在调整了PSA这一变量的共变分析中，有11个标记基因也仍然显著（HR为3.1-6.8），表明我们的标记基因适合于独立于PSA水平的预后。
表1
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