5+：不同阶段的免疫浸润模式探究

本次小编分享一篇2021年12月发表于Artif Cells Nanomed Biotechnol的文献，题目为《Bioinformatics analysis reveals the landscape of immune cell infiltration and immune-related pathways participating in the progression of carotid atherosclerotic plaques》，影响因子5.678。这篇文献通过生物信息学分析揭示了颈动脉粥样硬化斑块在不同阶段的潜在免疫浸润模式，促进了对免疫反应的理解，并为颈动脉粥样硬化斑块进展的免疫机制提供了有价值的见解。

动脉粥样硬化是一种与炎症细胞浸润和免疫相关通路激活相关的全身性疾病。在我们的研究中，我们旨在揭示其免疫相关的变化，并探讨颈动脉粥样硬化斑块发展中的新的免疫学特征。研究过程中应用了集成的生物信息学方法，包括CIBERSORT和基因集富集分析(GSEA)。从基因表达综合数据集(GEO)获得基因表达矩阵GSE28829, GSE41571和GSE43292。在一系列数据预处理步骤之后，使用CIBERSORT、GSEA和Cluster Profiler包分析得到的组合表达式矩阵。通过对颈动脉粥样硬化斑块早期和晚期的比较分析，我们发现，在颈动脉粥样硬化斑块中，激活记忆CD4 T细胞的比例较高，而静止记忆CD4细胞的比例较低。此外，记忆CD4 T细胞的激活可促进颈动脉粥样硬化斑块的形成。FOXP3+ Treg细胞成熟也可能参与颈动脉斑块的进展。

微阵列数据集：

本研究的原始基因表达谱GSE28829、GSE41571和GSE43292均从GEO数据库下载。GSE28829表达谱由16个晚期和13个早期斑块组成，GSE41571表达谱由6个晚期和5个早期斑块组成，GSE43292数据集由32个晚期和32个早期颈动脉粥样硬化斑块组成。晚期颈动脉粥样硬化斑块的定义是具有纤维帽的斑块，而早期颈动脉粥样硬化斑块的定义是内膜增厚和内膜黄色瘤。

数据预处理：

       为了从两个基因表达矩阵中获取关键信息，使用Perl脚本和R软件sva包对原始数据进行合并和预处理。然后，使用Perl脚本将每个基因的探针ID转换为一个基因符号。如果一个基因符号对应多个探针ID，则计算探针的平均表达水平作为该基因的代表性表达水平。

来自GEO表达阵列数据集的早期和晚期斑块组织中浸润免疫细胞的组成：

       利用GEO表达阵列数据首次研究了早期和晚期斑块组织间浸润免疫细胞的比例。在总共104个样本中，47个早期样本和53个晚期样本符合CIBERSORT的条件(p < .05)。如图1所示，免疫细胞的比例在不同样本和组之间有显著差异。M2巨噬细胞、M0巨噬细胞、naive B细胞、CD8 T细胞和静息CD4记忆T细胞是颈动脉粥样硬化斑块浸润前5位。相反，CD4 naive T细胞和嗜酸性粒细胞较少。同时，与早期斑块组织相比，晚期组织通常含有更高比例的CD4记忆激活T细胞和M0巨噬细胞(p值<.05)。然而，晚期斑块中CD8 T细胞、CD4记忆休眠T细胞、T细胞调节性(treg)、激活的自然杀伤细胞(NK)、单核细胞和休眠树突状细胞的比例较低(p值<.05)(图2)

图1.颈动脉粥样硬化斑块早期和晚期22个免疫细胞亚群的比例。(A)早期斑块；(B)晚期斑块。X轴：每个GEO样品；Y轴：每种免疫细胞的百分比。

图2.小提琴曲线图显示了早期斑块和晚期斑块免疫浸润的差异。早期斑块组为蓝色，晚期斑块组为红色。p-Value < 0.05

此外，我们对斑块内浸润免疫细胞进行相关分析，发现多对免疫细胞呈正相关和负相关(图3)。评分代表相关程度。这一结果表明，活化的肥大细胞和卵泡辅助T细胞具有最大的协同作用。同时，CD8 T细胞和M0巨噬细胞竞争效应最强。

图3.部分免疫细胞之间的共表达模式。红色：正相关；蓝色：负相关。

 PCA结果显示，免疫浸润的分数可以帮助我们区分早期斑块和晚期斑块(图4)。

图4.对菌斑样本进行主成分分析。

KEGG通路和GO分析显示免疫通路和基因组富集程度较高：

       为了探索与免疫功能相关的可能途径和基因集，将所有表达数据分为早期和晚期的斑块，然后进行GSEA分析。输出的结果与预期的免疫细胞和免疫相关功能高度相关。

       与早期斑块相比，晚期斑块中前20条KEGG通路主要富集于原发性免疫相关通路，如toll样受体信号通路、抗原加工与呈递、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、原发性免疫缺陷等;与免疫相关疾病相关的途径，如自身免疫性甲状腺疾病、哮喘、移植物抗宿主病和系统性红斑狼疮；与细胞因子激活相关的通路，包括趋化因子信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用(表1)。图5显示了10条具有代表性的免疫相关通路。

图5.GSEA中GO和KEGG的结果。A和B：10个具有代表性的免疫相关氧化石墨烯富集基因集；C和D：10个具有代表性的富集免疫相关KEGG通路。

表1. GSEA中前20个显著KEGG通路被DEGs富集，p <0.05

为探讨免疫相关基因在颈动脉斑块进展中的作用，采用GSEA进行GO分析。GO分析的前20个结果显示，早期和晚期斑块的基因功能变异主要富集在干扰素相关基因集，包括对I型干扰素的应答和对干扰素γ的应答。炎症细胞的功能包括调节白细胞迁移和正向调节白细胞迁移等免疫应答相关基因集(表2)。图5显示了10条具有代表性的免疫相关通路。

表2.GSEA中前20个显著的GO被DEGs富集，p < 0.05

此外，基于早期和晚期斑块间DEGs的GO和KEGG分析结果与GSEA相似(图6和7)。GO主要富集于炎症反应的调节、免疫效应过程的调节、白细胞脱粒的调节、髓系白细胞介导的免疫调节、白细胞迁移和对外界刺激反应的正向调节。KEGG通路主要富集于百日咳、金黄色葡萄球菌感染、PPAR信号通路、补体和凝血级联以及吞噬小体和病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用中。

图6.早期和晚期斑块间所有DEGs的热图。每一列代表一个颈动脉粥样硬化斑块样本，每一行代表一个DEG，由蓝色逐渐变为橙色，表示由下调到上调的变化过程。

图7.(A)DEGs富集的前6个显著GO；(B)DEGs富集的前6个重要KEGG通路。

GSEA免疫特征富集分析显示FOXP3+ treg细胞的成熟参与了动脉粥样硬化斑块的发生发展：

       为了表征与动脉粥样硬化斑块进展相关的免疫功能的深度特征，我们也使用GSEA来获得免疫特征基因集中富集的生物学过程。将所有表达数据导入GSEA，有1886个功能基因富集(FDR<25%；p值<1%)。前20个富集基因集列于表3。

表3.GSEA中最显著的20个免疫特征均富含DEGs, p <0.05

除与Foxp3+ Treg相关的基因组外，不同成熟度亚群均显著增加，其中GSE42021 CD24hi与CD24low Tconv胸腺降低；GSE42021 Treg PLN vs. CD24int Treg胸腺下降；GSE42021 Treg PLN vs. CD24lo Treg胸腺下降，GSE42021 Treg PLN vs. CD24lo Treg胸腺下降，这表明FOXP3+ Treg细胞的成熟过程可促进动脉粥样硬化斑块的恶化(图8)。

图8.四个具有代表性的富集免疫特征基因集，包括GSE42021 CD24hi vs. CD24int Treg胸腺下降；GSE42021 CD24hi vs. CD24LOW Tconv胸腺下降；GSE42021 Treg PLN vs. CD24int Treg胸腺下降；GSE42021 Treg PLN对CD24lo胸腺Treg下降。