本次小编分享一篇2021年3月9日发表于Elife的文献，题目为《Proteomic and transcriptomic profiling reveal different aspects of aging in the kidney》，影响因子8.140。本研究检测了6个月、12个月和18个月大的雄性和雌性多样性远系杂交(DO)小鼠的生理肾功能以及mRNA和蛋白水平。DO小鼠是一个遗传多样性的、远系繁殖的种群，每一种DO动物在基因上都是独一无二的，有可能揭示不同的年龄相关病理。遗传变异将驱动肾脏中大多数基因表达的mRNA和蛋白丰度的变异。通过描述mRNA表达和蛋白质水平之间的独特关系，来研究这种关系如何随年龄变化。
摘要：
人们对衰老过程中肾脏发生的分子变化知之甚少。为了更好地理解这些变化，我们测量了不同年龄的基因多样性小鼠的mRNA和蛋白质水平。我们观察到mRNA和蛋白质水平随着年龄的变化而发生显著变化。mRNA和蛋白质的变化与免疫浸润增加和线粒体功能降低有关。蛋白质显示出更大程度的变化，并揭示了一系列生物过程的变化，包括肾脏衰老的独特器官特异性特征。最重要的是，我们观察到，在mRNA没有相应变化的情况下，蛋白质发生了功能上重要的年龄相关变化。我们的研究结果表明，仅mRNA图谱就提供了肾脏分子衰老的不完整图像，而蛋白质变化的检测对于理解不受转录调控的衰老过程至关重要。
实验设计：
对6个月、12个月和18个月的约600只DO小鼠进行横断面老化研究，包括相同数量的雄性和雌性小鼠。为了评估肾功能，成功地收集了490只小鼠的尿液(6个月时141只，12个月时199只，18个月时150只)，并测量了白蛋白、肌酐和磷酸盐水平。通过RNA-Seq定量mRNA，检测了22259个基因的表达。获得了同一组188个肾脏样本的非靶向蛋白质组学数据，并量化了代表6515个独特基因的6580个蛋白质。
mRNA和蛋白质表达变化的来源：
为了确定衰老小鼠肾脏中mRNA和蛋白质变异的主要来源，我们计算了共6449个基因的主成分（PCs）。将数据转换为对正常分数进行排序，以减少异常值的影响。
RNA的前4个pc解释了46.5%的方差(图1A)。第一个PC解释了22.1%的方差，并与性别(p值<2.2 × 10−16)强相关，仅与年龄(p值= 0.050)弱相关。第二个PC (PC2)解释了总方差的15.3%，与性别(p-value = 0.30)或年龄(p-value = 0.87)无关。年龄对mRNA的影响在第三和第四个pc中是明显的，但这解释了5%或更少的总变异。总体性别是决定mRNA变异的主导因素，年龄的贡献较小。
图1.对6个月大（红色）、12个月大（绿色）和18个月大（蓝色）的女性（圆点）和男性（三角形）进行主成分分析。
蛋白质的前4个pc解释了总变异的39.1%(图1B)。第一个PC解释了16.6%，与年龄(p值= 5.3 × 10−14)密切相关，但与性别(p值= 0.24)无关。第二个PC解释了12.0%的变异。它与性别相关(p值< 2.2 × 10−16)，仅与年龄相关(p值= 0.014)。年龄和性别的影响在第三和第四个pc中是明显的，每个解释总变异不足5%。与mRNA相反，年龄是决定蛋白质变异的主导因素，性别的影响较小，但仍然很大。我们还观察到pc蛋白(尤其是PC1和PC4)的年龄特异性变异性在18个月大的动物中更大，这表明在后期动物间的蛋白质变异更大。相比之下，mRNA的变异在不同年龄组之间是恒定的。
mRNA表达与年龄相关的变化：
为了确定随年龄变化的转录本，我们应用了DESeq2的差异表达测试。我们鉴定出449个转录本显示出随年龄增长的趋势（调整后的p值<0.05），其中426个转录本显示出随年龄增长而增加的表达，只有23个转录本在减少。令人惊讶的是，95%的变化正在增加，但这是一个严格的家庭标准，只选择年龄相关变化最大的转录本。在使用错误发现率标准（FDR<0.1）的宽松严格性条件下，我们确定了4039个转录本随年龄变化，2649个（65%）正在增加。在426个mRNA物种中，我们发现了83个免疫球蛋白基因。这23种mRNA种类包括编码热休克蛋白的几种（Hsp90aa1、Hsp90ab1、Hsph1和Hspa4l）。
我们使用ClusterProfiler评估了GO。我们观察到与适应性免疫反应(调整后的p值= 1.3 × 10−23)、白细胞活化(调整后的p值= 4.9 × 10−25)和白细胞细胞-细胞粘附(调整后的p值= 1.4 × 10−16)相关的基因显著过表达。
图2.mRNA随年龄的差异表达分析。
与年龄相关的蛋白表达变化：
我们对蛋白质丰度数据应用线性混合模型ANOVA，然后应用秩正态分数转换，并包括协变量，以解释肽标记标签的边际效应、DO小鼠的产生和性别。我们鉴定了876种随年龄变化的蛋白质（调整后的p值<0.05）。其中352例随年龄增长而增加，524例随年龄增长而减少。具有最显著年龄趋势的蛋白质包括HIST1H1B和其他随着年龄减少的组蛋白；增加肌成纤维细胞ACTA2 a标记基因和肾纤维化指标；减少NCLN，它是内质网复合体的一部分；减少参与线粒体自噬的CISD2（图3）。
图3.不同年龄蛋白表达差异的例子。
我们观察到与跨膜运输相关的蛋白(调整后的p值= 1.7 × 10−19)和质膜(调整后的p值= 3.4 × 10−6)的大量变化，随着年龄的增加和减少。这些蛋白质与线粒体、内质网(高尔基和核膜)和质膜有关。后者是肾脏中特定细胞类型的标记物。为了更好地理解变化的混合模式，我们使用公开可用的单细胞的数据集(例如https://cello.shinyapps.io/kidneycellexplorer/)，其中使用免疫组织化学将蛋白质定位于小管的特定片段，以从富集类别中识别可能与特定细胞类型以及近端小管细胞的基底细胞和顶端细胞表面相关的基因（图4）。
图4.根据单细胞数据，肾单位不同部位特异性的一组随年龄变化的差异表达蛋白质，显示出随年龄变化的明显变化。
与年龄相关的mRNA和蛋白质变化的比较：
为了比较mRNA和蛋白质的年龄相关趋势，我们确定了6514个蛋白质(代表6449个不同的基因)具有相应的mRNA数据。为了进行分析，我们采用了自由错误发现率(FDR < 0.1)多次测试校正。为了提供解释年龄比较的参考点，我们还比较了性别之间的mRNA和蛋白质差异。
我们在1493个mRNA和3871个蛋白质中发现了显著的年龄趋势（FDR<0.1）。由于测量精度的潜在差异以及不同的统计测试方法，直接比较随年龄变化的具有统计意义的mRNA和蛋白质种类的数量变得复杂。然而，应用相同的统计标准，我们发现5325个mRNA和4412个蛋白质具有显著的性别特异性差异。这表明我们检测mRNA变化的能力并不不足。我们得出结论，与mRNA相比，蛋白质的年龄相关变化更为普遍，这与我们对上述变异的PCs的分析一致。
我们观察了mRNA和蛋白质在变化方向上的一致性。变化的绝对单位很难直接比较，因此我们将估计的倍数变化（mRNA）或趋势（蛋白质）转换为z值（估计/标准误差）。mRNA和蛋白质之间的年龄趋势相关性（r=0.235，p值<2.2×10−16） 为正且极显著，但远小于性别特异性差异的相关性（r=0.626，p值<2.2×10）−16). 我们确定了与年龄趋势一致的mRNA和蛋白质基因（A组，n=309），与mRNA减少和蛋白质增加不一致（B组，n=196），与mRNA增加和蛋白质减少不一致（C组，n=108），以及一致减少（D组，n=359）（图5A）。有更多的基因具有一致性变化（10.3%），但随着年龄的增长，有很大一部分基因的变化方向相反（4.7%）。我们根据变化方向（F>M或F<m< span="">）对性别特异性差异进行分类，分别在A-D类中发现1545、153、610和1391个基因。性别特异性差异更可能是一致的（42.7%），不一致基因的比例相对较小（11.7%）（图5B）。
图5.mRNA和蛋白质年龄相关变化的比较。
在每个年龄组中，mRNAs与其相应蛋白质的相关性主要为正。因此，这两组基因在mRNA和蛋白质之间表现出与年龄相关的相反变化方向，起初似乎呈现出一种悖论。例如，在近端小管（D组）中编码钠偶联乳酸转运体的基因Slc5a12显示，随着年龄的增长，mRNA和蛋白质水平显著降低（图6A）。然而，在每个年龄组中，我们观察到mRNA表达和蛋白质表达之间存在正相关。Flot1是C组中的一个基因，说明了相反的变化模式（图6B）。因此，虽然RNA和蛋白质通常在年龄组内是相关的，但RNA和蛋白质之间的相对平衡可以在不同年龄组的任何方向上发生变化。这表明，与年龄相关的蛋白质水平变化不一定是由转录调节引起的，也可能不跟踪RNA中与年龄相关的变化。
图6.mRNA和蛋白质之间年龄相关变化方向相反的基因示例。
为了进一步阐明转录调节在决定蛋白质年龄相关变化中的作用，我们对6667个基因的蛋白质和相应的mRNA进行了介导分析。我们评估了所有蛋白质中年龄趋势的显著性，无论是否考虑mRNA的变化（图7A）。如果与年龄相关的蛋白质变化完全或部分由mRNA的变化介导，那么在考虑mRNA后，蛋白质对年龄的回归意义应该降低。然而，我们基本上没有观察到年龄对蛋白质影响的显著性变化，并得出结论，与年龄相关的蛋白质变化独立于mRNA的变化。为了为我们的年龄对蛋白质影响的中介分析提供参考点，我们重复了相同的分析，以确定蛋白质水平的性别差异是否可以用相应的mRNA性别差异来解释（图6B）。在这里，我们看到在考虑了大多数基因的mRNA后，性别对蛋白质的影响显著降低。这与一个模型一致，在该模型中，蛋白质中的性别特异性差异是对mRNA中的性别特异性差异的直接反应。
图7.与年龄相关的蛋白质表达变化不是由mRNA表达介导的。
结论：
与年龄相关的蛋白质水平变化并不是由mRNA的相应变化驱动的。相反，它们反映了蛋白质稳态平衡的变化，与年轻动物相比，老年动物的蛋白质稳态发生了改变。年龄特异性变化的驱动因素与调节蛋白质性别差异的因素的作用方式不同。性别差异似乎在很大程度上是由mRNA的相应变化驱动的。尽管蛋白质和mRNA在年龄组内保持耦合，但与年龄相关的蛋白质和mRNA变化似乎是不耦合的。我们的研究结果表明，衰老动物的蛋白质稳态变化是转录后过程变化的结果——通过翻译效率或蛋白质周转的变化。这些变化似乎是在功能相关的基因组之间协调的。
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