7+：GEO和自己的测序数据一起分析

本次小编分享一篇2021年7月23日发表于Front Immunol的文献，题目为《Integrated Bioinformatics and Validation Reveal Potential Biomarkers Associated With Progression of Primary Sjögren's Syndrome》，影响因子7.561。该研究描述了严重pSS患者唾液腺特有的病理和超微结构变化，包括浆液和粘液腺泡萎缩，腺上皮细胞核萎缩，导管结构和基底膜损伤。此外，利用转录组测序和生物信息学分析结合临床数据确定了七个中心基因(MS4A1、CD19、TCL1A、CCL19、CXCL9、CD3G和CD3D)有潜在价值的评估pSS的严重程度和强烈的免疫反应与自身免疫微环境。

背景：原发性干燥综合征(pSS)是一种慢性全身性外分泌腺自身免疫性疾病，具有特殊的病理特征。先前的研究指出，与健康对照组相比，pSS患者的唾液腺表达独特的细胞因子、粘附分子和趋化因子。然而，支持个体标记物在pSS不同阶段的效用的证据有限。本研究旨在探索与pSS疾病进展相关的潜在生物标志物，并分析关键基因与免疫细胞之间的关系。

方法：我们将自己的RNA测序数据与NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)数据库的pSS数据集相结合，通过生物信息学分析鉴定差异表达基因(DEGs)。收集了14例pSS患者、6例非pSS患者和6例对照组的唾液腺活检。采用组织化学染色和透射电镜(TEM)对不同病程的唇唾液腺进行宏观和显微观察。然后，我们对中心基因进行了定量PCR验证。最后，我们使用CIBERSORT算法分析了选定的中心基因和免疫细胞之间的相关性。

结果：我们发现与健康对照组相比，pSS患者中有28个DEGs上调。这些主要涉及免疫相关通路和感染相关通路。根据小唾液腺的形态学特征，pSS疾病进展过程中可见严重的小叶间及导管周围淋巴细胞浸润，间质内腺泡萎缩及胶原蛋白，核萎缩，镜下细胞器肿胀。基于MS4A1、CD19、TCL1A、CCL19、CXCL9、CD3G、CD3D等28个DEGs的Hub基因作为潜在的生物标志物，通过RT-PCR进行验证。这些基因的表达与T滤泡辅助细胞、记忆B细胞和M1巨噬细胞相关。

结论：通过转录组测序和生物信息学分析，结合我们的临床数据，我们确定了7个关键基因，这些基因对评估pSS严重程度有潜在价值。

pSS中常见DEGs的鉴定：

本研究的工作流程如图1所示。为了研究pSS中常见的DEGs，我们下载了3个公共pSS数据集，包括大唾液腺(腮腺)(GSE40611)和小唾液腺(GSE127952, GSE154926)数据集。如图2A所示，共发现了47个上调和2个下调的常见DEGs(≥3例交叉)(|logFC|>1，p<0.05)。图2B表明这些DEGs是否在三个数据集的非pSS和pSS样本中被发现。为了系统分析常见的DEGs之间的关系，我们使用STRING数据库构建了一个PPI网络，并使用Cytoscape 3.4.0将数据可视化(图2C)。此外，在Cytoscape软件中使用DEGREE算法分析构建了一个DEG网络(图2D)。其中，CD3G、CD3D、CD2、B2M、CD19、MS4A1、CXCL9、CXCL13、IFI6、GZMK等枢纽节点被认为是pSS DEG序列中的枢纽基因。这些DEGs的鉴定为后续潜在pSS生物标志物的鉴定奠定了基础。

图1.该示意图显示了当前研究中用于识别原发性干燥综合征(pSS)进展相关的潜在生物标记物的方案。

图2.GSE40611、GSE127952和GSE154926数据集中的pSS和正常样本中的差异表达基因(DEGs)。

常见上调DEGs的功能及通路富集分析：

为了探索与pSS相关的潜在生物学过程，我们使用Cytoscape套件中的ClueGO插件对常见的上调的DEGs进行了通路分析。如图3A所示，我们观察到免疫相关信号通路的富集，如趋化因子信号通路、T细胞受体信号通路、抗原加工和呈递、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、Th1和Th2细胞分化等。导致炎症、上皮细胞解除管制和自身免疫反应的病毒被认为是pSS的致病驱动因素之一。与之前的研究一致，我们的研究结果表明，常见的DEGs也参与了与感染相关的途径，如eb病毒感染和病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用。通路相关基因如图3B和C所示。根据DAVID数据库，DEGs中与生物过程相关的前5个GO术语主要与病毒应答、免疫应答激活细胞表面、受体信号通路、T细胞激活、抗原受体介导的信号通路和淋巴细胞分化相关(图4A、B)。分子功能相关术语主要涉及细胞因子受体结合、抗原结合和趋化因子受体结合(图4C、D)。此外，质膜外侧、染色体、着丝粒区和内吞囊泡膜与细胞成分有显著的相关性(图4E-F)。这些基因可能与多种生物通路协调pSS发病机制有关。

图3.常见DEGs上调的ClueGO网络分析。

图4.上调的DEGs的功能富集分析。

识别pSS的候选生物标志物：

为了进一步验证上述生物信息学分析的结果，我们进行了RNA-Seq测序。如图5A和B所示，28个DEGs在GSE127952, GSE154926, GSE40611和我们的RNA-Seq数据中被鉴定为共同的，因此可能是有用的候选pSS生物标志物。为了进一步验证这些选择的DEGs的准确性，我们使用另一个pSS数据集(GSE159574)作为测试队列来生成ROC曲线。如图5所示汉英、共同度与T淋巴细胞(CXCL9、CD3D、CD3G、CD2、SH2D1A、SIT1、ZBTB32)，B淋巴细胞(MS4A1、BANK1、CD19、TCL1A、CXCL13、CCL19)，免疫反应(B2M、HLA-DRA IFI6、IFI44L、NLRC5、GZMK、GZMA、ADAMDEC1和CD247)和细胞生长(IFI27、SLAMF1、ZC3H12D、LAMP3)进一步评估(AUC>0.65)。这些常见的DEGs被认为是pSS的潜在生物标志物。

图5.常见DEGs生物标记物的鉴定。

潜在生物标记物与免疫细胞的相关性：

结果表明，hub基因在免疫相关通路和感染相关通路中高度富集。为了探索与这些潜在生物标志物相关的潜在机制，我们从GSE154926 pSS样本中提取了基因表达矩阵，并使用CIBERSORT算法来估计这些基因与与22种人类免疫细胞类型的pSS样本浸润之间的相关性。如图6所示，潜在的生物标志物MS4A1、CD19、TCL1A、CCL19、CXCL9、CD3G、CD3D与T滤泡辅助细胞(Tfh细胞)、记忆B细胞、M1巨噬细胞浸润呈正相关。这一结果表明，7个潜在的生物标志物和免疫反应之间有很强的相关性。

图6.CIBERSORT算法定义的枢纽基因和免疫细胞之间的关联。