49+：聚焦变异SARS-CoV-2

本次小编分享一篇2022年2月发表于Nature的文献，题目为《Evolution of enhanced innate immune evasion by SARS-CoV-2》，影响因子49.962。本篇文献介绍了对变异SARS-CoV-2的研究，现如今随着疫情发展，SARS-CoV-2也随着人类的防疫手段产生进化，小编身处2月份疫情爆发的苏州，格外关注这个问题，现将这篇文献分享给大家。

令人担忧的SARS-CoV-2变种的出现表明，病毒正在变异，从而更适应人与人之间的传播。很多研究都集中在对所关注的突变中的刺突蛋白变化的表征上，因为刺突外的突变可能有助于病毒的这种适应行为。在这里，使用无偏丰度蛋白质组学、磷蛋白质组学、RNA测序和病毒复制试验，我们发现Alpha (B.1.1.7)变异株比第一波分离株更有效地抑制气道上皮细胞的先天免疫反应。我们发现Alpha变异显著增加了核衣壳蛋白(N)、Orf9b和Orf6的亚基因组RNA和蛋白质水平，这些都是已知的先天免疫拮抗剂。Orf9b的单独表达通过与TOM70的相互作用抑制先天免疫反应，TOM70是一种线粒体蛋白，是激活RNA传感适配物MAVS所必需的。此外，Orf9b的活性及其与TOM70的关联受到磷酸化的调控。我们提出，通过增强特异性病毒拮抗剂蛋白的表达，更有效的先天免疫抑制，增加了α变异成功传播的可能性，并可能增加体内复制和感染持续时间。观察到Delta和Omicron变体的N和Orf9b调控区存在类似的突变，这突显了刺突编码区以外的突变在SARS-CoV-2适应人类的重要性。

先天免疫在2019冠状病毒疾病传播过程中发挥强大的选择性压力，并影响COVID-19的结局。我们假设阿尔法变体通过棘突蛋白外的适应性进化增强了先天免疫逃逸。感染第一波SARS-CoV-2的自然许可的Calu-3人肺上皮细胞诱导延迟的先天性反应，这是由RNA传感器RIG-I和MDA5的激活驱动的。与快速病毒RNA复制相比，延迟反应表明早期先天性免疫对抗和逃避是有效的。在这里，我们评估了复制和宿主对甲型和第一波分离物的反应的差异：B lineage BetaCoV/Australia/VIC01/2020（VIC）和B.1.13 hCoV-19/England/IC19/2020（IC19）（图1A）。使用包膜（E）RNA的病毒基因组和亚基因组拷贝（逆转录定量PCR；RT-qPCR）将输入剂量标准化。剂量正常化至关重要，因为输入病毒基因组水平与24小时的先天免疫激活相对应 在Calu-3细胞中感染后数小时（hpi）。平衡输入基因组还可以评估每个基因组的传染性，每个基因组的传染性可能因变体而异。因此，我们确认接种物中的E拷贝和传染性病毒粒子的测量值是相关的，并且α和第一波分离株之间的传染性（每个E拷贝的传染性单位）是可比。

图1.SARS-CoV-2 Alpha变体比早期谱系分离株更有效地拮抗先天免疫激活。

Alpha显示干扰素诱导减少：

我们发现，Alpha和第一波分离株的复制在高和低的感染多重性(MOI)下具有可比性，测量了细胞内E拷贝数、N阳性和传染性病毒粒子的产量(图1b-d)。我们观察到Alpha感染后N的阳性反应有少量但显著的增加(图1c)，我们稍后解释。由于双链RNA (dsRNA)中间体是被细胞感知的重要病原体相关分子模式(PAMPs)，我们还使用链特异性RT-qPCR (图1e)证实了Alpha和第一波分离株具有等效的负感RNA合成(图1e)。所有分离株在8 hpi的dsRNA阳性细胞中都达到了相似的水平。然而，Alpha分离株在6 hpi的细胞中dsRNA的总面积减少了，尽管在其他方面复制是相似的(图1f)。一种可能是Alpha N蛋白水平的增加(图1c)通过隔离dsRNA，导致表位掩蔽，有助于先天免疫逃逸。另外，Alpha可能通过转座因子的表达诱导更少的内源性dsRNA的产生，这些转座因子可以帮助PAMPs参与先天免疫感知。

每一株病毒复制水平相同，可以直接比较先天免疫反应，而不会混淆病毒数量的差异。我们发现，Alpha感染导致干扰素-β (IFNβ)的表达和分泌降低(图1g)，这一结果被3个独立的Alpha分离株证实(图1h)。变异株之间先天免疫激活的差异并不转化为Calu-3细胞中病毒复制的差异(图1)。因此，我们比较了在气液界面分化的人类原代气道上皮(HAE)细胞的复制和先天免疫激活。Alpha在HAE细胞中显示增强复制(图1i, j)，这可能是由于刺突蛋白中D614G突变的缺失，这使得在HAE细胞和动物模型中具有复制优势。

因此，我们比较了Alpha和IC19之间的先天复制和免疫激活，发现尽管Alpha复制显著增强(图1k)，但在72 hpi时，先天激活相似。在早期时间点，病毒复制在输入水平之外没有增加(24 hpi;图1i)，因此干扰素刺激基因(ISGs)没有被诱导(数据未显示)。然而，当在72 hpi时，将先天免疫激活标准化用于病毒复制时，注意到E拷贝可能不能完全代表病毒dsRNA PAMPs的数量，我们发现Alpha诱导的IFNβ和ISGs的表达低于每E拷贝IC19的表达。这与Alpha增强的先天免疫拮抗和图1k中相似的先天免疫激活相一致，因为Alpha在原发性HAE细胞中复制更有效。

由于干扰素敏感性与其他大流行病毒的传播相关，我们测量了干扰素β敏感性。与VIC相比，Alpha在大剂量范围内对IFNβ始终较不敏感。值得注意的是，IC19显示了IFNβ对α的敏感性类似的降低，这可能是由于突刺蛋白D614G的变化，这是IC19和Alpha共享的；这种突变与IFN抗性和提高进入效率有关。因此，α不仅诱导较少的IFNβ(图1g, h, k)，而且对抑制也不那么敏感。

Alpha增强先天拮抗：

为了比较宿主对SARS-CoV-2变异的整体反应，我们在10 hpi和24 hpi时对Calu-3细胞进行了质谱蛋白丰度、磷酸化分析和总RNA测序(RNA-seq)(图2a)。我们观察到感染驱动的RNA丰度和蛋白质磷酸化的变化，蛋白质丰度的差异较少。我们还观察到蛋白质磷酸化与蛋白质或mRNA丰度之间的相关性较差，这表明磷酸化是独立于蛋白质丰度变化驱动的。

全球RNA-seq和蛋白质组学揭示了Alpha的先天免疫抑制。

图2.全球RNA-seq和蛋白质组学揭示了Alpha的先天免疫抑制。

我们观察到α感染早期蛋白质磷酸化的总体变化较低（图2f）。因此，GSEA揭示了在10℃时磷酸化降低的途径 hpi——也就是说，活化降低与先天性免疫反应有关，与α增强的拮抗作用一致。值得注意的是，这一趋势在24岁时发生逆转 hpi作为α在感染后期引起磷酸化增强。这使我们研究了激酶信号级联的差异调节，尤其是与先天免疫信号有关的差异调节。我们利用磷酸蛋白质组学数据，根据已知底物的调节来估计191种激酶的激酶活性，并根据其时间动力学对激酶进行分组。值得注意的是，我们在蛋白质和RNA数据集中没有观察到激酶活性与丰度之间的任何相关性，这表明激酶活性的变化不是由激酶丰度的相应变化驱动的。我们从顶部富集项中鉴定了24种激酶（图2b），我们通过类似的途径成员对其进行了聚类（图2g）。10点 在hpi中，我们观察到TBK1以及蛋白激酶A、PRKDC、RET、AKT–mTOR、ERK和JNK途径的活性降低。鉴于TBK1在核酸传感中的核心作用，我们更详细地评估了已知的TBK1底物，以支持激酶分析（图2g），并确认已知的TBK1底物的磷酸化水平较低，包括RAB7A中的OPTN和Ser72，与10时的第一波分离物相比 hpi。24岁 hpi，即TBK1和PRKDC激酶的活性，以及JNK、ERK和PKA途径激酶的活性，与VIC相比，α增加（图2g），这与先天免疫系统富集途径中磷酸化增加一致。在24小时和48小时持续降低Alpha对干扰素的诱导 hpi（图1、2），尽管在24小时时TBK1的激活率较高 hpi表明TBK1下游具有拮抗作用；例如，通过增加SARS-CoV-2或F6的表达（图3），抑制炎症转录因子的核转运。与第一波分离株相比，感染α后促炎性mRNA诱导（IL6、IL8、CCL2和TNF）和细胞因子释放（CXCL10、IL6和CCL5）显著降低。这与Alpha抑制TBK1上游和下游通路导致的细胞活化持续减少一致。我们没有观察到CCL3诱导的差异，这表明病毒之间并非所有的炎症途径都受到不同的调节。因此，根据蛋白质磷酸化降低判断，Alpha增强的先天免疫拮抗作用仅在感染后的早期时间点观察到，表明与早期谱系病毒相比，参与病毒识别的信号通路的激活延迟。

图3.SARS-CoV-2 Alpha变体在亚基因组RNA和蛋白质水平上调固有免疫拮抗剂。

磷酸化调节Orf9b活性：

为了进一步了解宿主对Alpha反应的差异，我们使用RNA-seq数据集，通过将靶基因映射到相应的转录调控因子来估计转录因子的活性。我们从无偏倚RNA-seq通路富集分析中提取了富集度最高的前5个术语中显著调节的转录因子(图2b)。这表明IRF和STAT转录因子家族被Alpha激活的程度明显低于第一波病毒(图4a)。一致地，单细胞免疫荧光检测IRF3核易位显示，与VIC感染相比，Alpha感染后IRF3的激活减少(图4b)。STAT1、STAT2和IRF9位于I型IFN受体的下游，Alpha的强效抑制与Orf6水平的升高一致，已知Orf6抑制STAT1和IRF3的核易位。

图4.Orf9b结合TOM70，拮抗RNA感应下游的固有免疫激活。

第一个重组VOC的鉴定也强调了Alpha适应对避免先天免疫的重要性。该变体已在Orf6–Orf7连接点周围重组，将δ变体增强的进入、furin裂解和抗体逃逸的棘突蛋白适应与Alpha变体增强的先天免疫拮抗作用结合起来，通过增加N、N*和Orf9b蛋白的表达介导。VOC间重组是大流行中的一个关键进展，与已知重组在冠状病毒多样性产生中的重要性相一致，在这种情况下，重组与Alpha和δ适应有关。我们的发现强调了研究棘突蛋白以外的变化对预测当前和未来挥发性有机化合物行为的重要性，并强调了先天免疫逃避在SARS-CoV-2适应人类的持续过程中的重要性。