癌症研究新方向：可变剪切

Abstract

越来越多的证据表明，可变剪切（AS）在癌症中经常被修饰，并且与癌症进展有关。本文通过分析和筛选，对结直肠癌（结直肠癌）全基因组AS事件进行了分析，并确定了与CRC相关的AS事件。进一步的富集分析证实，这些AS事件（DEAS）的基因在结直肠癌中发挥重要的作用。剪接相关网络为这些CRC相关AS事件如何受到关键剪接因子的调控提供了新的见解。此外，一些被与生存相关的AS事件可能对AS在CRC肿瘤发生中有潜在价值，并为进一步验证治疗靶点提供线索。

Results

1. CRC中的AS事件

使用从627名CRC患者获得的RNA-Seq数据建立了的AS事件，包括334名（53.2%）男性和293名（46.7%）女性患者，其中199名患者（18.9%）发生复发，130名（20.7%）患者死亡。使用SpliceSeq，从13201个基因中识别出总共82411个AS事件。根据它们的剪接模式，这些AS事件大致可以分为七种类型，包括外显子跳跃（ES）、外显子互斥（ME）、内含子保留（RI）、启动子替代（AP）、终止子替代（AT）、供体位点替代(AD) 和受体位点替代(AA)，如图2a所示。经过过滤筛选，从8942个基因中获得了34334个AS事件，这表明一个基因可能平均有近四个AS事件（图2b）。考虑到这一点，生成了UpSet图来可视化每个AS类型的交集。如图2c所示，大多数AS事件来自一个基因，而一个基因可能有多达四种类型的AS事件。值得注意的是，大于81.6%的基因包含两个或多个AS 事件，这些AS事件的不同组合丰富了转录组的多样性。最后，为了直观地可视化CRC的AS事件，创建了Circos Plots以显示染色体中AS事件及其对应基因的详细信息（图2d）。

2. CRC相关异常AS事件的识别

原发性结直肠癌与相应的相邻正常组织之间显着不同的AS事件可能在结直肠癌的整个过程中发挥重要作用。因此，分析了从50对肿瘤和正常组织中获得的AS，以识别差异表达的AS (DEAS)。最终，从372个基因中初步筛选出421个DEAS，其中有174个AP、81个ES、76个AT、57个RI、18个AD、14个AA 和1个ME（图3a)。

有趣的是，DEAS 和整个AS之间AS类型的比例不一致。作为数量最多的AS类型，ES事件（36.8%）仅占17.9%的DEAS。对这些DEAS进行层次聚类，肿瘤和正常样本清楚地分为两个离散组，这表明上面筛选的DEAS是可信的（图3b）。异常AS事件可能直接影响其对应RNA的表达，尤其是在发生AT或AP事件时。为了研究DEAS与差异表达基因 (DEG) 之间的关系，我们分析了DEG中发生的DEAS（图3c）。正如预期的那样，DEG中94.4%的DEAS是AT（44.4%）和AP（50.0%）。图3d描绘了识别出的一部分DEAS，它将转录本的变化汇总为一个有向无环图，将外显子表示为矩形节点，将剪接点表示为边。此外，为了直观地显示原发性CRC和相邻正常组织之间这些AS事件的差异，生成了散点图与箱线图（图3e）。CRC相关AS事件在CRC生物学中起着至关重要的作用，需要进一步研究。

3. DEAS的富集和交互分析

AS可以通过多种机制直接影响蛋白质功能。因此，可以通过分析其相应的蛋白质来阐明DEAS的潜在影响。基于DEAS相关基因的PPI网络分析不仅证明了正常情况下的交互关系，而且揭示了AS事件对整个网络的潜在影响（图4）。

4. DEAS与剪接因子的相关网络

AS事件主要受剪接因子调节，剪接因子与前体mRNA结合并影响外显子选择和剪接位点选择。通过对文献和数据库的手工筛选，首先确定了71个剪接因子。这些剪接因子的表达从TCGA CRC队列的RNA测序数据中获得。接下来，在CRC队列中进行这71个剪接因子的表达水平与每个DEAS事件PSI值之间的相关性分析，建立剪接调控网络。在图5A所示的剪接相关网络中，33个DEAS事件，包括22个上调的AS事件（红点）和11个下调的AS事件（蓝点），与37个剪接因子（灰点）显着相关。大多数剪接因子（灰点）与多个AS事件相关，其中一些在不同AS事件中起相反的调节作用（图5a）。此外，从网络中可以看到不同的剪接因子在竞争相同的结合位点（AS事件），部分解释了转录本可以产生几种不同剪接异构体的原因。剪接因子与特定AS事件之间的相关性显示在点图中（图5b-g）。例如，TRA2A的表达与SULT1A3的AT呈负相关（图5C），而与FOXK1的AP呈正相关（图5E）。

5. DEAS 在 CRC 中的预后价值

在TCGA队列中研究了DEAS与CRC预后之间的关系。CRC患者根据PSI值中位数分为两组。然后分别进行OS和DFS的单变量生存分析，总共发现37个DEAS事件与OS相关，68个DEAS事件与DFS相关。在同时与OS和DFS相关的DEAS事件中（图6a）。通过多变量分析进一步评估DEAS事件，以确定CRC中的独立预后指标。如图6b所示，分别有4和11个DEAS事件可以被识别为OS和DFS的独立预后指标。从上述分析结果中，CXCL12中的AT和CSTF3中的RI是CRC队列中OS和DFS的独立预后指标。根据PSI值（CXCL12中的AT和CSTF3中的RI的中位数）对患者进行分层，OS和DFS的Kaplan-Meier生存分析差异显著。以上结果直接表明DEAS事件不仅具有重要的生物学意义，而且具有潜在的临床价值。

6. 与预后和分子亚型相关的AS簇

对所有样本进行一致性聚类分析（k=4）（图8a），确定了四组样本如下：C1(n=164，26.1%),C2(n=161,25.6%),C3(n=242,38.5%), C4(n=57,9.8%) （图8b）。图8c表明AS簇之间CRC样本中不同CMS、TNM分期、KRASm和生存状态（OS和DFS）的分布总体上不是随机的。因此，进行了Kaplan-Meier分析以评估AS簇与预后之间的关系。结果表明，AS簇与不同的生存模式相关（图8d）此外，未发现AS簇和MSI之间的关联，但CMS1包含大多数具有MSI的肿瘤（图8e）。总的来说，这些发现表明，整个CRC中AS的性质存在相当大的差异，这会影响临床结果。

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