年度最佳方法：空间解析转录组学

介绍

    最初，在研究人员为大规模RNA测序准备样本的过程中，组织被均质和分析，以获得组织细胞(其转录组)中的mRNA的平均基因表达；当单细胞RNA测序(scRNA-seq)被开发出来时，它带来了对每个细胞转录组更精细的评估，在scRNA-seq中，研究人员将细胞从组织中分离出来，例如，根据基因表达来辨别细胞类型。艾伦脑科学研究所(Allen Institute for Brain Science)所长曾宏奎说，研究单细胞更像是在吃水果沙拉，而不是在喝冰沙。现在，利用空间解析的转录组学方法，科学家们可以获得转录组学数据，并知道这些细胞在组织中的位置背景。“水果挞是空间转录组学，”艾伦研究所研究员Bosiljka Tasic说，他与曾宏奎共同接受了采访。她说：“你能准确地知道每一片水果的位置，以及它们之间的关系。”。空间分析还不能提供所有单细胞的转录组范围的信息，但这一领域正在朝着单细胞的方向快速发展。卡罗林斯卡学院(Karolinska Institute)的生物学家斯滕·林纳松(Sten Linnarsson)说，生物学“完全是关于环境的”。空间单细胞转录组学是单细胞分析之后的下一波潮流，他说这将对实验室研究人类疾病特别有用，因为人类疾病通常始于单细胞。“如果我能做梦，在几年内，我们将在活体组织中实现时空单细胞组学”，这将使单细胞的发展实现一个完整的循环。

    科学、癌症研究或发育生物学等领域提供空间解析的转录组数据。“我认为未来是光明的，”华盛顿大学的Jay Shendure说。他最感兴趣的是如何应用这些方法来获得结合细胞状态、历史和命运的空间分解的发育图谱。“这是一个非常活跃的领域，”曾说。哈佛大学(Harvard University)的庄晓伟(Xiaowei Zhuang)是霍华德休斯医学研究所(Howard Hughes Medical Institute)的研究员，他一直在影像领域做研究。她和她的实验室开发了一种超分辨率显微镜方法——随机光学重建显微镜(STORM)。当单细胞基因组学出现时，她开始思考并努力寻找一种将成像和基因组学结合起来的方法，以“获得两个世界最好的一面”。Hubrecht研究所(Hubrecht Institute)所长、由物理学家转行的生物学家亚历山大·范·欧德纳登(Alexander van Oudenaarden)说，从2012年左右开始出现的方法，尤其是那些在单细胞序列的同时捕捉空间信息的方法，已经融合了之前分离的成像、测序和分子表征领域。他和他的实验室将单细胞转录组学和空间转录组学结合起来，比较了类胃体和小鼠胚胎中的基因表达。对单个细胞的研究起源于19世纪，比如鲁道夫·魏尔肖(Rudolf Virchow)的观察发现，疾病开始于细胞，而不是整个有机体。十年前，当van Oudenaarden和其他人在显微镜下观察细胞在生长的生物体中生长和迁移时，“我们总是有点嫉妒测序的世界。”他和他的团队可以制作延时电影并捕捉复杂的过程，但只能用少量荧光蛋白标记基因表达。现在已经有可能评估许多单细胞和许多基因，并跟踪细胞的组织背景和它们的空间属性。“有各种各样的聪明方法来保存空间信息，”他说。“这是一项非常令人兴奋的技术。”

    正如瑞典皇家理工学院生命科学实验室的Joakim Lundeberg及其同事所指出的，空间技术可以分为两种，一种是对显微解剖组织进行基因表达分析，另一种是原位杂交、原位测序、原位捕获，空间数据的计算重建。曾宏奎说，单分子荧光原位杂交(smFISH)是基于空间技术的“基于杂交方法的开端”。在这种方法中，多个寡核苷酸携带荧光标签并与RNA分子结合。来自艾伦研究所、生命科学实验室和卡罗林斯卡学院的研究人员指出，smFISH可以产生“接近100%的检测灵敏度”的定量mRNA readout。

Compute that space

    约翰霍普金斯大学(Johns Hopkins University)的计算癌症生物学家埃拉娜·费蒂格(Elana Fertig)说：“事实上，它并不能完美地解析每个细胞，我对此没有意见。”不过，在理想情况下，她希望获得单细胞分辨率。她研究的是肿瘤异质性，空间技术可以帮助解决这个问题。她的一个项目是评估T细胞对肿瘤的浸润。该实验室侧重于多组学，整合来自不同模式的数据，研究人员使用来自多种空间分析方法的数据。她发现10x Genomics的Visium技术比FISH更容易获得。分子的变化可以定义肿瘤的类型，但肿瘤在这些类别中有很大的不同。“细胞类型并不是二元的，”她说。她想知道到目前为止，流式细胞术是否已经可以确定细胞类型。观察带有许多细胞标记的样本，现在可能会得到一个细胞身份的连续体。对于这项工作，团队科学变得更加重要，它可以迭代发现，开发数据分析和可视化方法来搜索出计算工件。Fertig实验室是美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)癌症研究信息学技术项目的一部分，该项目旨在构建解释高维组学数据的框架，这些数据将越来越多地包括空间数据。随着每个单元有更多的标记，数据的高维性增加了数据解释的挑战。“我认为这是空间领域目前面临的挑战，”她说。为了整合成像和单细胞数据进行空间转录分析，她和她的团队应用迁移学习覆盖基因相关特征并进行降维。

    Macosko预见了一个计算机发展的阶段，即围绕着寻找空间可变基因或寻找利用空间信息的轨迹。Shendure表示，尽管付出了很多努力，但管理数据和跨平台整合仍然是一个巨大的挑战。每次实验都会产生大量的数据，研究人员面临着如何保存哪些数据、丢弃哪些数据的决定，并且不希望偏离基因组学中开放数据共享的原则。

Data juggling

    在艾伦研究所(Allen Institute)，像大脑细胞类型这样的大型项目就像处理大型数据集一样司空见惯。艾伦的塔西克说，当观察单细胞和空间转录组数据时，每个细胞有数以万计的特性，他们能如此快地达到标准分析的边界，这甚至让他们感到惊讶。“数据矩阵变得难以管理，”她说。他们与生物界以外处理大规模数据矩阵的人合作。她说，未来的计算道路是艰巨而令人兴奋的。她在研究生院测量所有单细胞中所有基因的梦想开始实现。即使是用相同方式捕获的数据，在不同批处理之间也可能略有不同，因此必须进行规范化。为了整合成像、测序和电生理学等多种模式，她和她的团队构建了聚类方法，并借鉴了不同类型的机器学习方法。

    van Oudenaarden说，有很多机会可以通过计算将单细胞RNA-seq和空间信息结合起来，将单细胞映射回空间，并建立和使用参考地图和工具。他对从原位杂交参考数据库或不使用地图的方法重建空间地图的计算方法很感兴趣。novoSpaRc就是这样一种方法，它可以在没有地图的情况下进行“基因表达制图”。这是基于基因表达在组织切片中如何变化的假设。van Oudenaarden说，拥有更多关于组织的数据是一个很好的问题。这些财富使得研究重要的“骨骼”——生物学的核心部分——成为“一个更大的难题”。对他来说，单细胞组学和空间方法的结合“确实是产生假设的一种方式，”他说。需要用单独收集的数据来确认和验证调查结果。

Atlas at hand

    空间分析对于大脑倡议细胞普查网络(Brain Initiative Cell Census Network, BICCN)至关重要，该项目由美国国立卫生研究院(US National Institutes of Health)资助，在该项目中，许多实验室共同工作，制作参考人类、小鼠和非人灵长类动物的大脑图谱。它涉及成像、电生理学和分子遗传学分析，如转录组学和表观基因组学。艾伦小鼠大脑图谱的工作始于所有小鼠基因的原位表达图谱，以显示解剖和空间基因表达模式。“这是一个被广泛使用的参考数据库，”曾说，她指导BICCN的小鼠大脑全脑图谱项目。Tasic说，该团队正在小鼠和人类大脑中构建细胞类型的“周期系统”。她领导了一个BICCN项目，该项目是关于用于全脑标记的细胞类型特异性工具和以细胞类型特异性方式研究电路的方法。研究界很快就会有特定细胞类型的参考地图集，他们可以在上面绘制自己的发现。在其他论文中，BICCN团队最近发表了一份哺乳动物初级运动皮层的多模态细胞普查和图谱。曾说，BICCN的第二阶段正在启动。在这些新项目中，有一些致力于细胞型靶向工具，以应用空间和分子信息，干扰细胞，并描述它们在电路和行为中的作用。

    最近的阿特拉斯的鼠标初级运动皮层单细胞基因组学已经席卷生物学界。为了通过转录组细胞类型绘制小鼠初级运动皮层的30多万个细胞的空间组织，他们选择了庄的MERFISH，一种多重误差强荧光原位杂交技术。他们将MERFISH与Patch-seq等其他方法结合起来，后者用电生理学测量细胞，然后进行测序。

Future in space

    Macosko说，单分子FISH和单细胞基因组分析已经成为一组将基因组学的大规模假设生成技术引入细胞生物学和组织生物学的方法，这将为思考和技术发展奠定基础。研究人员将能够在空间环境中对基因表达进行精细的研究，并进行其他测量，如酶的过程和细胞之间、基因之间和蛋白质之间的相互作用。这将改变细胞生物学以及病理学和组织学的实践方式。

写在最后，如果老师对生信分析感兴趣或想要分析相关内容的话，欢迎长按识别二维码联系我们！

微信公众号

中科生信

新浪微博

@中科生信