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早！今天小编和大家分析一篇2022年12月发表在《BMC Pulmonary Medicine》（IF:2.8）期刊上的文章《The identifcation and verifcation of hub genes associated with pulmonary arterial hypertension using weighted gene co-expression network analysis》。作者通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）分析、构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI），鉴定肺动脉高压中的潜在生物标志物。本研究可为肺动脉高压的诊断及治疗提供参考。该思路同样适用于其他非肿瘤的研究，有相关需求的老师欢迎联系我们。
一
背景
肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一种严重的心血管疾病,以肺血管阻力和肺动脉压进行性升高为特征,病因复杂,预后不良,最终会导致右心衰竭和死亡。目前，PAH的治疗主要包括利尿剂、氧疗等支持疗法、药物疗法和心肺移植等手术治疗。即使如此，肺动脉高压仍无有效治疗方法，其死亡率仍居高不下。近年来，大量的研究利用基因表达芯片去识别复杂疾病的潜在生物标志物，以进一步探索其潜在的发病机制和潜在的治疗靶点。
加权基因共表达网络分析 (WGCNA) 可以用于识别基因与微阵列样本之间的相关性，并且可以通过将具有相似表达谱的基因聚类来识别基因与临床特征的关联。因此，可以通过 WGCNA 在心血管疾病和癌症中发现与疾病相关的中枢基因。
二
方法
1，GEO公共数据库获取 PAH 患者及正常对照数据；
2，R 软件中的“limma”包用于筛选 PAH 和对照组之间的差异表达基因（DEG）；
3，R 软件中的 WGCNA 包用于加权基因共表达网络分析，识别关键模块；
4，R软件中的“org.Hs.eg.db”包和“cluster profiler”R包用于关键模块的GO和KEGG富集分析；
5，GSEA用于功能富集分析；
6，STRING用于蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）的构建；
7，MCODE用于筛选PPI网络的重要模块，Cytohubba 用于中枢基因的鉴定；
8，RT-qPCR用于对中枢基因的验证。
三
研究结果
1
差异表达基因（DEG）的鉴定
共鉴定出 2298 个差异表达基因，与对照组相比，PAH中有1140个基因上调，1158个基因下调。（图2A-B）
2
加权基因共表达网络分析（WGCNA）
用R软件中的WGCNA包对上述差异表达基因进行进一步处理，建立无标度共表达网络（无标度R 2 > 0.8），软阈值幂为9（图3A）。通过建立共表达网络，将DEG 聚类成七个模块（图3B），计算每个模块之间的相关性，其中黄色模块（0.74，P < 0.0001) 是与 PAH 相关的最高的模块（图3C）。因此，黄色模块（597 个 DEG）就是与 PAH 相关的关键模块。
3
功能富集分析
将上一步得到的关键模块中的597个DEG进行GO和KEGG分析。GO富集结果表明，关键模块基因在BP中富集于transcription, DNA-templated, signal transduction 和positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter（图4A）。在CC方面，主要富集于cytoplasm, proteinaceous extracellular matrix 和lamellipodium（图4B）。MF方面，关键模块基因富集于protein binding, metal ion binding和zincion binding （图4C）。此外，KEGG 分析表明，关键模块模块富含Pathways in cancer, PI3K-Akt signaling pathway, 和Focal adhesion（图4D）。
1
GSEA分析
使用 GSEA 软件分析了来自 PAH 患者和对照的所有基因表达数据的通路基因集的分布。结果显示，27/50个基因组在 PAH 患者中上调，而13个基因组在FDR < 25% 时显着富集。在对照组中，23/50 个基因组被上调，12个基因组在FDR < 25%时显着富集。GSEA 的结果表明，PAH 患者富集于HALLMARK_MYC_TARGETS_V1、E2F_TARGETS、MTORC1_SIGNALING、DNA_REPAIR、G2M_CHECKPOINT和GLYCOLYSIS通路（图5A-F）。
5
PPI网络构建、模块化分析和hub基因分析
利用STRING数据库构建PPI网络，以探索关键模块中基因的相互作用。PPI 网络包含 230 个节点和 520 个边（图6A）。使用 Cytoscape 中的 MCODE 插件，确定了一个模块。该模块包括 7 个节点和 42 个边（图6B）。将MNC、MCC和Degree三种算法得到的基因通过韦恩图筛选最终得到四个中枢基因，包括VEGFA、KIT、PNISR和HNRNPH1（图6C）。
6
中枢基因的验证
基于RT-qPCR 实验，对中枢基因PNISR和HNRNPH1进行验证。结果表明，与对照组相比， CoCl2处理组中PNISR和HNRNPH1的表达水平均上调，这与生物信息学分析一致（图7A-B）。为了评估PNISR和HNRNPH1区分CoCl 2处理组和对照组的能力，进行 ROC 曲线。结果显示，PNISR和HNRNPH1的 AUC分别为 0.815（95% CI 0.690-0.905；P < 0.0001）和 0.744（95% CI 0.611-0.850；P = 0.0005），表明已鉴定的中枢基因PNISR和HNRNPH1可能是 PAH 的新型生物标志物（图7C-D）。
四
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析
