肝细胞癌中鉴定出与失巢相关的亚型和预后模型

    今天小编和大家分析一篇2023年2月发表在《International Journal of Molecular Sciences》（IF:4.5）期刊上的文章《Identification of Anoikis-Related Subgroups and Prognosis Model in Liver Hepatocellular Carcinoma》。本文主要基于失巢凋亡相关基因进行分子聚类，并构建与验证失巢凋亡相关预后风险模型，评估了高、低危险人群免疫细胞浸润的不同特征。本研究发现了与HCC肿瘤微环境相关的新型调节基因，这对HCC预后预测和治疗具有重要意义。该思路同样适用于其他肿瘤的研究，有相关需求的老师欢迎联系我们。

背景：

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是最常见的癌症之一，是全球第四大死亡原因，也是第二大致命恶性肿瘤。尽管诊断工具的可用性有限，如组织学和放射学检查，但对快速、准确和方便的HCC诊断方法仍有很大需求。因此，开发新的诊断方法来监测HCC的进展至关重要。尽管临床相关生物标志物如甲胎蛋白（AFP）通常用于HCC诊断，但其应用仍存在许多争议和局限性。因此，开发新基因对HCC的诊断和预后具有重要意义。

失巢凋亡（Anoikis）是一种程序性细胞死亡，由细胞和细胞外基质（ECM）之间的相互作用丧失而触发。抗失巢凋亡是许多癌症细胞的一个关键特征，可促进细胞存活。然而，HCC中失巢凋亡的机制尚不清楚。因此，揭示HCC失巢的细胞特征和分子机制至关重要，这将有助于HCC治疗和预后的发展。

方法：

1，R包“TCGAbiolinks”用于鉴定组间DEG；R包“VennDiagram”用于可视化维恩图结果；

2，R包“ConsensusClusterPlus”用于鉴定TCGA-LIHC数据集的无监督亚组和集群；分别使用R包“broom”、“Rtsne”和“umap”绘制PCA、t-SNE和UMAP聚类结果；“survival”和“survminer”R包用于分析和绘制K-M曲线；R包“ComplexHeatmap”用于可视化不同亚组和亚群的基因表达；

3，R包“GSVA”和“msigdbr”探索不同亚组之间生物学过程的差异；采用ssGSEA算法计算免疫细胞浸润；

4，WGCNA包用于识别与LIHC显著相关的模块；

5，单变量Cox比例风险回归和LASSO分析用于构建风险模型；ROC曲线用于评估模型的性能；R包“rms”用于绘制列线图；

6，CIBERSORT算法用于计算肿瘤浸润免疫细胞的含量。

研究结果：

（一）差异表达的失巢凋亡相关基因的鉴定

首先在TCGA-LIHC中鉴定了6311个DEG（图1A）。然后，在GeneCards数据库中鉴定了448个失巢凋亡相关基因，将两者交叉得到168个差异表达的失巢凋亡相关基因（图1B）。

（二）失巢凋亡相关亚群的鉴定

为了识别失巢凋亡相关亚组，作者基于168个交叉基因对TCGA-LIHC患者进行无监督聚类，将患者分为A和B两个亚组（图2A）。主成分分析（PCA）显示了两组之间样本之间分区明显（图2B）。t分布随机邻域嵌入（t-SNE）和均匀流形逼近和投影（UMAP）分析验证了该结果。此外，A组的生存概率低于B组（图2C）。进一步显示了168个交叉基因在A和B两组中的表达热图（图2D）。这些结果表明，可以根据失巢相关基因对TCGA-LIHC患者进行分类。

（三）两个亚组之间生物学功能的差异

为了探索两个亚组之间的不同生物学过程，作者进行了基因集变异分析（GSVA），以确定两个亚群之间不同的KEGG和Reactome途径。结果表明，A亚组在高尔基池-心室周堆叠重组、NIMA激酶NEK9、NEK6和NEK7的激活以及前期染色体的浓缩中高度富集。A亚组还富含背腹轴形成、肌醇磷酸代谢和notch信号通路（图2E）。应用ssGSEA算法来探索两个亚组之间的免疫浸润水平。结果表明，两组具有不同的免疫浸润模式（图2F）。此外，A亚组的免疫细胞（包括活化的CD4、IDC、MDSC、记忆B细胞、NK细胞和TGD）的丰度明显高于B亚组，而B亚组的免疫力细胞（包括激活的CD8、巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞和PDC）的丰度显著高于A亚组（图2G）。这些结果表明，两个亚组在KEGG途径、Reactome途径和免疫浸润水平方面具有不同的特征。

（四）识别与LIHC显著相关的模块

为了在168个失巢凋亡相关基因中寻找高度相关基因，作者进行了WCGNA以鉴定高度相关的基因模块。设定软阈值功率为5（图3A），并基于基因树图识别了三个基因模块：绿松石模块、棕色模块和蓝色模块（图3C）。显示了不同模块之间相关性的热图（图3B）。在这些基因模块中，肿瘤发生与绿松石模块之间存在强烈的相关性（系数为0.62，p值为8×10−47，图3D）。此外，在绿松石模块中，基因显著性（GS，即基因与临床性状之间的相关性）和模块成员关系（MM，即基因和模块之间的关联）高度相关，表明该模块中的基因与肿瘤最显著相关（图3E）。最后，从绿松石模块中提取了75个基因用于GO和KEGG途径富集分析。结果表明，这些基因在凋亡过程中显著富集，以及与凋亡过程的正负调节相关。此外，这些基因还在正调节失巢中高度富集（图3F）。KEGG通路富集分析表明，这些基因在人类免疫缺陷病毒1感染、乙型肝炎和丙型肝炎中富集，这与癌症的发展和进展一致（图3G）。总之，绿松石模块中的基因与肝细胞癌的发生、转移和发展高度相关。

（五）与失巢凋亡相关基因簇的鉴定

接着，基于75个基因对TCGA-LIHC患者进行再聚类，将TCGA-LIHC患者分为3个集群（A、B、C）（图4A），并使用PCA分析进行验证（图4B）。此外，集群A的生存概率低于集群B和C（图4C）。基因表达热图显示了三个集群之间的差异（图4D）。

（六）失巢凋亡相关预后风险模型的构建

为了构建一个与失巢凋亡相关的预后风险模型，作者从LIHC数据集中随机抽取了183个样本作为训练集，182个样本作为测试集。使用单变量Cox比例风险回归分析75个基因来筛选候选预后基因，并根据p值<0.05确定了55个基因（图5C)。对这55个基因进行LASSO回归分析（图5A和5B），最终选定5个特征基因构建风险评分。根据风险评分的中值将患者分为两组。在测试数据集中，风险评分高的患者往往比风险评分低的患者生存概率低，死亡时间早。此外，两个风险组之间预后基因的基因表达谱显著不同。此外，测试数据集中预后基因的总体生存率、生存时间和基因表达谱与训练数据集中的一致（图5D、5E、5F、5G）。

此外，作者预测了训练集和测试集中的总体生存率。测试数据集中1年、3年和5年的ROC曲线（AUCs）下的面积分别为0.81、0.763和0.696（图6A）；训练集中分别为0.796、0.727和0.826（补充图S4A）。在训练集和测试集中，与低风险患者相比，高风险患者的预后基因表达显着上调（图6B和补充图S4B）。在训练数据集中，所有预后基因均与不良生存概率显著相关（补充图S4C–G），但只有SPP1和BSG与测试数据集中的不良生存概率明显相关（图6D）。列线图显示，风险评分在预测1年、2年、3年、4年和5年的总生存率方面起着关键作用（图6C）。总的来说，成功建立了失巢凋亡相关预后风险模型，并在预测癌症的总体生存率方面表现良好。

（七）失巢凋亡相关预后风险模型的验证

ICGC和GEO数据集用于验证失巢相关预后风险模型的性能。结果表明，与风险评分低的患者相比，风险评分高的患者生存概率更低，死亡的可能性更大。此外，与低风险组相比，高风险组的预后基因显著上调，DAP3除外（图7A-7D）。此外，ICGC数据集中预测模型的AUC分别为0.777、0.733和0.853（图7E），BAK1、BSG和PBK与不良生存概率显著相关（补充图S5A-E）。预后基因表达的不同模式也与TCGA数据集一致（补充图S5F）。这些结果与TCGA数据集中的结果相似，表明失巢凋亡相关的预后风险模型在预测总生存率方面具有很强的性能。此外，与GSE84402中的正常样本相比，肿瘤样本中预后基因的相对表达显著上调，SPP1除外（图7F）。GSE101685也是如此，BAK1和BSG除外（图7G）。还使用人类蛋白质图谱（HPA）数据库验证了预后基因的蛋白质水平，该数据库显示，与正常样本相比，所有预后基因的蛋白表达在肿瘤样本中均上调（补充图S6）。

（八）两种危险人群免疫细胞浸润的不同特征

根据上述结果，我们发现了两个亚组、三个集群、两个风险组和两个临床结果的分布和关系（图8A）。此外，我们发现两个亚组和三个集群之间的风险评分存在显著差异（图8B-8C）。接下来，使用CIBERSORT算法来探索浸润性免疫细胞与风险组之间的相关性。结果表明，风险评分与单核细胞（cor=0.26，p≤0.00001）、巨噬细胞M0（cor=0.15，p=0.00363）、M1（cor=0.22，p=0.00002）、M2（cor=0.25，p=0.00227）、静息NK细胞（cor=0.022，p＝0.00003）、静息树突状细胞（cor:0.21，p=.00006）、活化肥大细胞（cor=1.19，γδT细胞（cor=0.18，p=0.00064）、浆细胞（cor=0.17，p=0.00135）和滤泡辅助T细胞（cor=0.13，p=0.01375）呈现正相关；与嗜酸性粒细胞（cor＝−0.22，p＝0.00003）和静息肥大细胞（cor−0.16，p等于0.00212）呈显著负相关（图8D-8G和补充图S7A–H）。除DAP3外，还发现预后基因与大多数免疫细胞高度相关（图8H）。