早！今天小编和大家分析一篇2023年3月发表在《Front Aging Neurosci》（IF:4.3）期刊上的文章《Identification of anoikis-related genes classification patterns and immune infiltration characterization in ischemic stroke based on machine learning》。本研究首次全面分析了失巢相关基因（anoikis-related genes, ARGs） 在缺血性脑卒中（Ischemic stroke, IS）中的作用，揭示了ARGs在IS中的表达谱及其与浸润免疫细胞的相关性。而且，ARGs对IS患者的分子分型具有指导意义。通过机器学习筛选出IS中的五个特征基因（AKT1、BRMS1、PTRH2、TFDP1和TLE1），并通过列线图模型评估特征基因预测IS的发生概率。进而探索了这些特征基因可能参与的分子调控网络。本研究为阐明IS的发病机制提供有益的参考，为IS的药物筛选、个体化治疗和免疫治疗提供新的思路。该思路同样适用于其他非肿瘤的研究，有相关需求的老师欢迎联系我们。
背景：
脑卒中是导致全球第二大死亡和残疾的重要因素，每年造成550万人死亡。缺血性脑卒中（Ischemic stroke, IS）约占所有脑卒中患者的80%。尽管tPA是IS的主要治疗选择，但由于治疗时间窗狭窄、再灌注损伤和再出血并发症，大批IS患者面临的严重脑损伤风险。先前的研究表明，IS产生免疫反应，导致神经元损失和组织修复，而神经元损失也可能导致脑卒中后免疫稳态的破坏。此外，IS通常伴随着免疫细胞的变化，包括巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、单核细胞、T细胞、自然杀伤T细胞、γ-δT细胞、Tregs、B细胞。然而，IS背后的免疫反应机制在很大程度上是未知的。因此，新特征基因的鉴定可能为IS提供潜在的治疗靶点或病因见解。
失巢（Anoikis）是程序性细胞死亡的一种形式，本质上是一个细胞凋亡的过程。当细胞与正确的细胞外基质分离时，失巢细胞破坏整合素连接，从而阻止异常增殖细胞生长或附着在不合适的基质上。越来越多的证据表明失巢调节免疫反应，这对IS的发展做出了巨大贡献，但失巢相关基因（anoikis-related genes, ARGs）在IS发病机制中的作用很少被探索。
方法：
1，Limma用于分析组间样本之间的差异表达基因；
2，CIBERSORT用于计算22种浸润免疫细胞类型的相对比例；通过Wilcoxon比较不同组之间的免疫细胞比例；
3，Consens-usClusterPlus R包用于进行无监督聚类分析；
4，使用R包“GSVA”和“limma”来分析不同簇之间改变的途径和生物功能；
5，利用LASSO、SVM、RF来筛选特征基因；Venn用于多个基因集取交集；“pROC”R包绘制ROC曲线；R包“InpROC”计算曲线下面积（AUC）；rms绘制列线图；
6，clusterProfiler用于GO和KEGG富集分析；
7，Spearman用于分析特征基因与免疫细胞之间的相关性；
8，NetworkAnalyst和DGIdb分别用于预测miRNA/TF-基因关系网络。
研究结果：
（一）ARG在IS患者中的表达谱
本研究的流程图如图1A所示。GSE58294作为训练集，GSE16561作为验证集。从GSEA网站获得了35个ARGs。
首先，分析了35个ARG在数据集GSE58294中的表达谱，结果显示，22个ARGs的表达谱发生了改变，其中9个ARGs（CAV1、CEACAM6、IKBKG、ITGA5、PDK4、PIK3CA、PTRH2、SNAI2、TFDP1）的表达水平上调，而13个ARGs（AKT1、BCL2、BMF、BRMS1、CEACAM5、MAP3K7、MCL1、NOTCH1、NTRK2、PIK3R3、SIK1、STK11、TLE1）的表达表达水平下调（图2A和图2B）。同时，22个ARGs的染色体位置被可视化（图2C）。这22个ARGs之间的相关性表明，一些ARGs，如STK11和TFDP1、AKT1和NOTCH1、MCL1和NOTCH2，显示出强烈的协同作用，而MAP3K7分别与STK11、BRMS1和ITGA5显示出显著的拮抗作用（图2D和图2E）。
（二）IS患者的免疫谱及其与ARGs的关联
使用CIBERSORT算法计算了GSE58294的每个样本中22种浸润免疫细胞类型的比例差异。结果表明，在IS患者中，活化记忆性CD4+T细胞、卵泡辅助T细胞、单核细胞、M0巨噬细胞、静息树突状细胞和中性粒细胞显著上调，而幼稚B细胞、CD8+T细胞和静息肥大细胞显著下调（图3A和图3B）。这意味着IS会引起免疫系统的变化。同时，免疫细胞之间的相关性分析表明，幼稚B细胞、嗜酸性粒细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、静息肥大细胞、中性粒细胞、活化记忆CD4+T细胞、浆细胞和调节性T细胞（Tregs）与ARGs联系紧密（图3C）。这些结果表明，ARGs对IS患者免疫浸润状态的改变有很大贡献。
（三）IS中失巢相关簇的鉴定
为了进一步阐明ARGs在IS中的表达谱，作者使用一致性聚类算法，根据22个ARGs的表达对69个IS样本进行分组。将k的值设置为2-9，并发现当k = 2，CDF曲线的一致性指数在最小范围内波动，一致性得分相对较大，表明相对较好的k值为2（图4A-4D）。作者在GSE16561数据集中对其进行了验证，此结果与训练集中的结果具有一致性。此外，主成分分析（PCA）的结果显示，两个聚类之间存在显著差异（图4E）。因此，69名IS患者被分为两组，包括簇1（n= 41）和簇2（n= 28).
（四）与失巢相关的不同簇的免疫微环境和生物功能特征的鉴定
接着，作者分析了22个ARGs在簇1和簇2之间的表达差异，结果显示AKT1、SIK1和TLE1在簇1中显著高表达，而CEACAM6、STK11和TFDP1在簇2中显著高表达（图5A和图5B）。为了进一步探索不同簇之间免疫微环境特征的差异，作者分析了浸润免疫细胞及其免疫功能的差异。结果显示，簇1表现出高比例的幼稚B细胞，而簇2表现出高比例的浆细胞、静息记忆CD4+T细胞和M2巨噬细胞（图5C和图5D）。这一证据表明不同簇之间存在不同的免疫谱。接下来，基于GO和KEGG基因集进行了GSVA分析。GO结果表明，T细胞谱系测定、B细胞增殖、B细胞增生的调节、B细胞活化和免疫球蛋白在免疫应答中的体细胞多样性在簇2中上调，而几丁质结合、半胱氨酸蛋白酶结合、轴突动力蛋白复合物，嗜蓝颗粒内腔和Alditol Napplus 1氧化还原酶活性反而下调（图5E）。KEGG结果显示，JAK-SAT信号通路、细胞因子-细胞因子-受体相互作用、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、抗原处理和呈递、B细胞受体信号通路、T细胞受体信号途径、细胞凋亡和TOLL样受体信号通路在簇2中上调，而甘油磷脂代谢、同源重组，系统性红斑狼疮、细胞色素P450对外源性物质的代谢和药物代谢细胞色素P40在簇2中反而下调（图5F）。
（五）LASSO模型、SVM模型、RF模型的构建与验证
作者通过三种算法（LASSO、SVM、RF），从22个ARGs中选择候选基因来预测IS的发生。LASSO模型的结果显示，14个基因与IS的发生有关，包括AKT1、BCL2、BRMS1、CEACAM5、CEACAM6、ITGA5、MAP3K7、MCL1、NOTCH1、PTRH2、SNAI2、STK11、TFDP1和TLE1（图6A和图6B）。同时，使用支持向量机（SVM）识别了10个特征变量，包括AKT1、BRMS1、TLE1、TFDP1、PTRH2、PIK3CA、STK11、BMF、NOTCH1和MAP3K7（图6C）。通过随机森林算法，识别出6个相对重要性得分大于2的特征基因，包括AKT1、TLE1、BRMS1、PTRH2、TFDP1和PIK3CA（图6D和图6E）。最后，将从三个机器学习模型中获得的基因进行交叉，得到5个ARGs（AKT1、BRMS1、PTRH2、TFDP1和TLE1）进行后续分析（图6F）。接着，对五个ARGs进行了GO和KEGG富集分析。GO结果显示，这些基因主要参与失巢、失巢调节、DNA结合转录因子活性调节、RNA聚合酶II转录调节复合体和DNA结合转录转录因子结合等（图6G）。KEGG结果表明这些基因在碳水化合物消化和吸收、Notch信号通路、Fcε-RI信号通路和B细胞受体信号通路以及其他通路中富集（图6H）。
（六）特征基因诊断价值的分析
接下来，进行ROC分析并计算ROC曲线的AUC值，以评估每个特征基因诊断的准确性。结果表明，五个基因在训练集GSE58294中都具有相对较高的预测值（图7A）。同时，在验证集GSE16561中对五个特征基因的诊断价值做了进一步的验证（图7B）。
（七）建立用于预测IS的列线图
通过整合特征基因构建列线图来进一步诊断IS（图8A）。在列线图中，每个特征基因对应一个分数，通过将所有特征基因的分数相加来获得总分。总分对应于IS的不同风险。校准曲线显示出了列线图预测IS发生的准确性（图8B）。临床影响曲线也显示了列线图模型的显著预测能力（图8C）。决策曲线分析所示，IS患者可以从列线图中获益（图8D）。
（八）特征基因与免疫浸润细胞之间的相关性分析
接着，作者将GSE58294和GSE16561进行整合，在整合数据集中分析5个诊断基因的基因表达与免疫细胞浸润之间的相关性。结果表明，AKT1与静息树突状细胞、CD8+T细胞、幼稚CD4+T细胞，幼稚B细胞和静息NK细胞呈正相关。AKT1与M2巨噬细胞、浆细胞、活化树突状细胞、卵泡辅助T细胞、静息CD4+记忆T细胞、静止Mast细胞和γ-δT细胞呈负相关（图9A）；BRMS1基因与幼稚CD4+T细胞和静息树突状细胞呈正相关，与浆细胞呈负相关（图9B）；PTRH2基因与γ-δT细胞、卵泡辅助T细胞、记忆B细胞、单核细胞、M2巨噬细胞、静息记忆CD4+T细胞和静息肥大细胞呈正相关；PTRH2基因与幼稚CD4+T细胞、M1巨噬细胞、幼稚B细胞和静息NK细胞呈负相关（图9C）；TFDP1基因与中性粒细胞、单核细胞、活化肥大细胞、浆细胞和M0巨噬细胞呈正相关。TFDP1基因与幼稚B细胞、活化的CD4+记忆T细胞和CD8+T细胞呈负相关（图9D）；但TLE1基因在整合数据集中没有显示出统计学上的显著差异。总的来说，这些基因的表达可能与多种免疫细胞的浸润水平有关，这意味着这些关键的诊断基因可能参与IS发病机制中的免疫调节。
（九）分子调控网络的构建
然后，分别构建了基因-miRNA（图10A）和基因-TF的调节网络（图10B）。结果表明，有大量miRNA和TF参与了这些诊断基因的调节。此外，还构建了AKT1的药物-基因相互作用调控网络。结果表明，有30种药物或分子化合物对AKT1有作用，其中22种对其有抑制作用（图11）。总的来说，这些结果可能为这些基因未来在疾病诊断、疾病亚型分类、生存预测、药物敏感性分析等方面的应用提供方向。
