早！今天小编和大家一起分享一篇今年2月发表在Frontiers in Immunology杂志（IF: 6.786）的文章《Cuproptosis-related genes score: A predictor for hepatocellular carcinoma prognosis, immunotherapy efficacy, and metabolic reprogramming》。在该研究探讨了铜诱导的肝细胞死亡的机制。研究重新筛选了与铜离子载体诱导的死亡有关的基因。这些数据是从Peter Tsvetkov提供的全基因组CRISPR-Cas9功能丧失筛选数据集中获取的。探讨了铜死亡相关基因与肝细胞癌预后之间的关系，并利用这些基因建立了预后预测模型，该模型在铜诱导的细胞死亡方面显示出对肝细胞癌进行分级的潜力。
背景&方法
铜在肝细胞癌(HCC)发生发展中的作用尚不清楚。此外，一些研究证明铜有助于肝癌的发生和发展。铜有助于糖酵解代谢和HCC的致瘤性。铜配合物[Cu(ttpy-tpp)Br2]Br(简称CTB)可诱导肝癌细胞衰老，通过SLC25A26和甲硫氨酸循环发挥抗肿瘤作用。双硫仑联合铜通过NF-κB和TGF-β通路抑制肝癌转移和上皮间质转化。铜代谢MURR1结构域10(COMMD10)增加细胞内铜含量，导致肝癌放射抵抗。此外，在患有Wilson病的患者和动物模型中，HCC发病率的增加被发现与铜蓄积导致的促进恶性进程的未知机制有关。铜死亡的出现为铜基治疗HCC提供了新的思路。
方法
1.肝细胞癌转录组数据集从TCGA和ICGC数据库。GSE14520和GSE125449数据集从GEO数据库获得。HCC的单细胞数据是从TISCH数据库中下载的。
2.OVISE细胞用于筛选铜死亡相关基因。
3.采用临床特征参数和预后特征建立列线图，定量研究肝癌患者1年、3年和5年生存的概率。
4.使用“clusterProfiler”R软件包对两组患者进行GO和KEGG通路富集分析。
5.通过R软件中的TIMER，CIBERSORT和CIBERSORT-ABS算法评估每个样本的肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的比例。
6.人HCC细胞系PLC/PRF/5和Huh7的培养，并进行qPCR和蛋白印迹分析。
7.用CCK8检测细胞的存活率。
8.用HPA数据库获取免疫组化结果，通过图像测量GLS的相对表达水平。
研究结果
FDX1、GLS、CKKN2A、DLAT、LIAS是HCC患者的独立预后因素
利用两个铜离子载体(Cu-DDC and elesclomol-copper)对全基因组CRISPR - Cas9阳性筛选，我们筛选出27个可能参与铜离子载体诱导细胞死亡的基因，其中25个基因被纳入LASSO回归模型。通过最小准则确定了LASSO回归中的最优惩罚系数(λ = 0.00542)。TCGA和ICGC数据集的生存分析结果显示，FDX1、GLS、CDKN2A、DLAT和LIAS是HCC患者的独立影响因素，可能有助于预测HCC的预后。同时，它们在HCC肿瘤和正常组织中存在差异表达。此外，单细胞测序表明5个基因均包含在GSE125449中，且主要在恶性细胞中检测到（图1）。
铜死亡相关基因风险评分可预测HCC患者的不良后果
利用LASSO回归模型，基于TCGA数据库中的患者数据，构建包含上述5个基因的预测模型。铜死亡相关基因(CRG)风险评分= 0.53 * GLS + 0.42 * DLAT + 0.505 * CDKN2A-0.135 * FDX1-0.491 * LIAS。风险评分分布和结局状态显示，在两个队列中，更多的HCC患者死亡发生在风险评分较高的人群中。TCGA-LIHC数据集(训练队列, p = 0.033)中高危组比低危组生存时间短。在另外两个验证队列(ICGC-JP中p = 8.4 × 10-06 , GSE14520中p = 0.036)中也观察到类似的结果。从TCGA中得到总生存(OS)预测模型的曲线下面积(AUC)，1年为0.83，3年为0.73。在两个外部验证队列中，模型在ICGC-LIRI数据集中的AUC值在1年时为0.92，3年时为0.75，而在GSE14520数据集中的AUC值在1年时为0.77，3年时为0.76（图2）。
基于临床病理特征和CRG风险评分的综合列线图的开发和验证，供临床应用
分析该模型与HCC患者临床病理特征的关系。如图3A所示，age, gender, race, prior malignancy, and radiation therapy对预后的预测无统计学意义。此外，在TCGA队列和ICGC队列中，CRG评分与病理分期相关。另一方面，根据TCGA和的临床数据，CRG模型的高评分是低OS的独立危险因素。为了更好地量化风险模型对单个HCC患者的预测值，创建了列线图，校准曲线显示了风险模型在训练和测试队列中的稳定性和准确性（图3）。
该基因标签与HCC的多种代谢特征密切相关
铜死亡的特点是脂酰化蛋白的聚集，这些蛋白参与了线粒体中发生的TCA循环过程。杯状细胞病和线粒体蛋白之间的联系表明，CRG风险评分对HCC代谢的影响需要进一步分析。基于TCGA数据集对两组的基因集富集分析（GSEA）显示，低CRG组的HCC患者在代谢相关的途径上有富集，如丙酮酸代谢、脂肪酸代谢、丙氨酸-天门冬酰胺代谢或谷胱甘肽代谢。具体来说，谷氨酰胺被认为是癌症中仅次于葡萄糖的第二重要营养物质。它的代谢开始于由GLS转化为谷氨酸。谷氨酸可以被转移到线粒体，转化为α-酮戊二酸，并参与TCA循环。至于谷胱甘肽（GSH），尽管只在细胞液中利用半胱氨酸、谷氨酸或甘氨酸产生，但GSH在许多细胞器中也很丰富，包括过氧体、细胞核、内质网和线粒体。富集分析证实，高CRG HCC患者的代谢相关变化集中在嘧啶代谢或嘌呤代谢。嘧啶代谢与嘌呤代谢一起，最终在细胞核、细胞质和线粒体中产生脱氧核苷三磷酸酯（dNTPs），用于细胞增殖（图4）。
该基因标签可作为免疫靶点和免疫治疗反应的有价值的标志物
肿瘤免疫学在HCC的发展和进展中起着关键作用。该研究评估了CRG的免疫状况，发现高CRG患者的免疫得分明显高于低CRG患者。此外，利用TIMER算法，研究初步注意到两组巨噬细胞、B细胞、CD4+T细胞和中性粒细胞的得分不同。根据CIBERSORT和CIBERSORT-ABS算法的结果，在免疫细胞的亚型中呈现出更具体的特征，如巨噬细胞M0、M1和M2。在CIBERSORT中，巨噬细胞M0的免疫浸润分数在高危组中较高，而其他两种亚型在两组之间没有统计学上的显著差异。根据CIBERSORT-ABS，高危组的三个亚型都高于低危组。ssGSEA分析发现高危组和低危组或风险分数的免疫细胞亚群、免疫功能和途径。结果显示，在TCGA队列的高风险组中，免疫细胞包括巨噬细胞骨髓DC、Tregs细胞、中性粒细胞和CD4+Th2细胞明显表达。关于免疫功能，低风险组的脂质介质、糖原代谢、葡萄糖剥夺和TCA循环的风险水平高于高风险组，此时G1/S和G2/M的功能与这些功能相反。依靠TCGA数据集发现高危组和低危组的免疫检查点不同，如BN2A1、BTN2A2、CD276、CD47、CD70和HLA都在高危组高表达。对于PD-L1，两个数据集中高CRG组的PD-L1表达量都比较高，这证明了PD-L1和杯状细胞病变之间的相关性（图5）。
索拉非尼作为晚期HCC患者的一线治疗药物。因此，我们评估了索拉非尼对不同CRG风险患者的疗效，发现索拉非尼治疗的反应遵循GLS、DLAT、FDX1、LIAS的相对表达量和CRG的风险评分(GSE109211)。评分越低的患者对索拉非尼治疗越敏感。在对BCLC A或B期HCC患者广泛使用的肝动脉化疗栓塞( TACE )治疗的分析中也观察到类似的结果。对TACE治疗有反应的患者，GLS、CDKN2A、FDX1的表达水平有显著变化，CRG的值较高（图6）。
GLS与HCC的不良预后和细胞凋亡相关
GLS在多因素Cox回归分析中HR最高，引起该研究的关注。在TCGA队列中，GLS的表达水平与病理分期相关。通过伊利司莫初步验证了CuCl2在肝癌细胞系中与铜死亡相关的功能。结果证实Cu2 +的加入增强了伊利司莫的作用。GLS基因表达量的降低降低了伊利司莫-Cu诱导的细胞死亡。此外，在PLC和Huh7中敲低GLS基因后，对索拉非尼更加敏感，与之前的预测一致。GLS的免疫组化染色显示其在HCC组织中高表达。HCC组包括低阳性、阳性、高阳性，阳性率约为61%。非HCC组阳性率约24%。对3个数据库进行系统分析后，GO分析表明它们富集在肌动蛋白结合、Ras GTPase结合等。同时，KEGG分析表明GLS与Ras信号通路相关。综上所述，体外实验数据提示GLS的高表达与HCC患者的肿瘤细胞凋亡及不良预后相关（图7）。
结论
综上，本研究利用LASSO Cox回归模型构建了基于铜死亡相关基因的新型CRG。高CRG评分的HCC患者被揭示与较短的生存时间、代谢相关通路的低富集以及促肿瘤免疫细胞的高浸润评分相关。在我们的模型中，在所有纳入的CRG基因中，GLS被标记为HCC发生发展过程中的功能基因，可能参与了HCC的铜死亡过程。
