今天小编和大家分析一篇2023年1月发表在《Albany NY》（IF:4.8）期刊上的文章《A two-gene random forest model to diagnose osteoarthritis based on RNA-binding protein-related genes in knee cartilage tissue》。
本研究旨在探讨RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBP）相关基因在骨关节炎（Osteoarthritis, OA）中的诊断价值。基于GSE114007数据集，通过各种生物信息学和机器学习方法，识别RNMT和RBM24，然后将其纳入随机森林（RF）诊断模型，本研究为阐明OA分子机制提供了一个有前途的临床工具和可能的切入点。该思路同样适用于其他非肿瘤的研究，有相关需求的老师欢迎联系我们。
背景：
骨关节炎（Osteoarthritis, OA）作为全球最常见的疾病之一，严重影响患者的生活质量，并带来巨大的社会经济负担。OA的致病因素主要包括遗传、代谢、炎症和生物力学的改变，导致软骨破坏和骨碎裂。然而，鉴于除人工关节置换术外，现有的药物治疗无法治愈OA。因此，迫切需要研究潜在的分子机制，以更好地阐明病因和发病机制，并开发新的治疗剂。
RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBP）被定义为一组能够区分和结合靶RNA，从而影响这些RNA的转录、编辑、剪接和其他生物过程的蛋白质。RBP对维持体内平衡至关重要，RBP的紊乱会导致一系列疾病，如炎症疾病、代谢相关疾病、恶性癌症和遗传病。据报道，RBPs也参与OA的病理过程。例如，RBP PUM1可以通过下调TLR4来减轻OA引起的软骨破坏；CPEB1是一种与靶RNA的3′-UTR细胞质多腺苷酸化元件结合的RBP，在OA患者的软骨样本中上调，并与疾病的严重程度有关；RBP-Samd4的缺乏可能导致小鼠软骨形成缺陷；这些证据证明RBP在OA中发挥着不可忽视的作用。然而，目前对RBPs在OA发生和发展中的作用的理解还远远不够，相关研究目前还处于起步阶段。寻求更多的RBPs作为OA的生物标志物是重要而有意义的。
方法：
1，Limma用于分析基因的差异表达；
2，Metascape用于分析差异表达基因的功能；
3，STRING用于构建PPI网络；cytoHubba插件用于评估网络中基因的重要性；
4，Glmnet包用于进行LASSO；Boruta包进行Boruta算法；Caret包进行SVM-RFE算法；Rms包进行单变量逻辑回归；
5，RandomForest包用于构建诊断模型；
6，GeneMANIA和clusterProfile分别用于共表达基因的鉴定和功能分析；
7，qRT-PCR和WB分别用于检测关键基因的mRNA表达和蛋白质表达水平。
研究结果：
（一）差异表达的RBPs的鉴定
本研究的流程图如图1A所示。从先前的研究中获得1525个RBPs，在GSE114007中分析这些RBPs的表达差异，得到62个差异表达的RBPs，38个上调和24个下调基因（图2A和图2B）。Metascape的功能注释显示，这些差异表达的RBP参与了多个关键的细胞过程，包括ncRNA代谢过程、mRNA代谢过程、核酸磷酸二酯键水解、mRNA监测途径，信使核糖核酸代谢过程的调节，核糖核酸代谢，脱氧核糖核酸甲基化或去甲基化、程序性细胞死亡疾病，揭示了这些RBP在OA发病机制中的潜在生物学功能（图2C）。
（二）PPI网络分析
为了检测62个基因的潜在相互作用，将这些基因上传到STRING数据库中，以构建PPI网络（图3A）。接下来，使用Cytoscape中的cytoHubba应用程序对这些基因在网络中的重要性进行量化，选择表现出最高连接程度的前20个基因进行进一步研究，包括EIF4A3、DDX28、KHDRBS3、AEN、CLK3、EIF4E2、RBM24、NIP7、ZFP36、NOVA1、CELF2、PABPC4L、CLP1、MYEF2、RNMT、PUS1、XAB2、EXO1、FDXACB和RPS27（图3B）。
（三）RBM24和RNMT被确定为OA的潜在诊断生物标志物
通过Lasso回归评估62个RBP中的重要基因，其中15个被确定为特征基因，（图4A），这15个特征的参数如图4B所示。为了使预测模型更加简洁，作者同时结合了多种机器学习算法进一步筛选特征基因。SVM-RFE算法确定了37个与结果显著相关的变量（图4C）。单变量逻辑回归确定了47个基因。Boruta算法识别37个基因（图4D）。最终将四种算法和PPI的结果取交集，得到2个关键基因RNMT和RBM24（图4E）。
（四）RF模型的构建和外部验证
基于RBM24和RNMT的表达，建立了RF诊断模型，并给出了建模参数。RF模型在训练数据集GSE114007（AUC=1.000，95%CI=1.000-1.000，图5A）和GSE117999数据集中（AUC=0.900，95%CI=0.769-1.000，图5B）显示出区分OA样本和对照病例的高效性。训练数据集和GSE117999数据集中的混淆矩阵分别显示在图5C和图5D中。另外，通过RT-qPCR测量RBM24和RNMT的表达，结果显示，与对照样品相比，RBM24（P < 0.05，图6A）和RNMT（P < 0.05，图6B）在OA样品中均下调。RF模型还可以在一定程度上诊断临床样本队列中的OA（AUC = 0.759，95%CI = 0.568–0.951，图6C），图6D显示了相应的混淆矩阵。
（五）RBM24和RNMT与OA的发生有关
ROC分析揭示了RBM24和RNMT在训练数据集（RNMT，AUC=0.906；RBM24，AUC=8.889；图7A）、GSE117999数据集（RNMT，AUC=0.840；RBM224，AUC=5.590；图7B）和临床样本队列（RNMT、AUC=0.855；RBM24，AUC=0.736；图7C）中对OA的预测能力。作者观察到，除了GSE117999队列中的RBM24外，这些队列中的变量都表现出较高的诊断值（AUC>0.7）。同时，RNMT的平均下降准确度和平均下降基尼系数均优于RBM24（图7D），这表明RNMT是比RBM24相对更可靠的生物标志物。最后，作者在体外构建了OA模型，并检测了RNMT和RBM24的RNA和蛋白质水平。RT-qPCR和Western Blotting表明，在OA模型组中，RNMT（P<0.05）和RBM24（P<0.01）均下调，如图7E和图7F所示。这些证据表明，RBM24和RNMT都是OA的关键生物标志物，并与OA的发展有关。
（六）RBM24和RNMT的功能注释
与RBM24和RNMT最相关的前20个基因分别如图8A和图8B所示。基因本体论（GO）分析表明，RBM24及其相关基因主要富集于肌肉发育和分化以及RNA代谢、剪接和加工（图8C），而RNMT及其相关基因则主要参与RNA合成和修饰、ATP酶活性和丝氨酸/苏氨酸激酶活性（图8D）。这些结果可能为阐明RBM24和RNMT在OA中的作用提供线索。
