6+铁死亡教你做深层次的免疫分析

背景&方法

背景：在GC中，铁死亡与肿瘤细胞增殖和癌症疗效有关。铁死亡是一种程序性细胞死亡，由铁死亡的脂质过氧化诱导。此外，据报道，铁死亡的增加有助于免疫疗法的抗肿瘤疗效。因此，深入研究GC中的铁死亡将有助于澄清对肿瘤发生的理解，并开发出治疗GC的有效方法。先前研究表明，铁死亡参与调节 CD4+T细胞的稳态，在感染期间和接种疫苗后增强了滤泡辅助T细胞的功能。然而，铁死亡在GC微环境调节中的作用以及铁死亡相关基因（FRGs）的上游调节因子值得进一步探索。

结果

与铁蛋白酶有关的基因在胃癌的发生和发展中发挥关键作用

为了确定参与胃癌发生过程以及预后的关键基因，我们对TCGA-STAD数据集中375个胃癌（GC）和32个邻近正常组织的公共RNA-Seq数据进行了深入分析。根据TCGA-STAD数据集中GC样本的表达情况，与邻近的正常组织相比，分析了GC组织中9712个差异表达基因（DEGs）（fold change >1.5，P值<0.05）（图2A）。在这些DEGs中，7015个在GC中上调，2697个在GC中下调（图2A）。为了评估FRG在胃癌中的表达并确定其在胃癌发生中的作用，我们从以前的研究中获得了289个FRG。在TCGA-STAD数据集中，近65%（289个中的187个）的FRG在GC组织和相邻粘膜之间有差异表达（图2A）。其中，133个FRGs是GC上调的，54个FRGs是GC下调的（图2A）。对上述FRG的GO富集分析显示了多个与GC相关的信号通路，以及与铁蛋白生成有关的关键通路。GC上调的FRG在细胞对过氧化氢的反应和细胞铁离子平衡途径中明显富集，而GC下调的FRG在氧化-还原过程、对cAMP的反应和细胞周期停滞等GO词中富集，表明摄铁症在GC中的关键作用（图2B）。此外，7个差异表达的FRG与预后良好显著相关，5个差异表达的FRG与预后不良显著相关（图2C）。这12个基因在TCGA-STAD数据集中的表达水平见图2D,E。

根据每个基因的中位表达水平，将TCGA-STAD队列分为高组和低组，所有12个基因都与预后显著相关（P＜0.05，图3A，B）。其中，7个GC上调的FRG（LONP1、MYB、PSAT1、TP53、HNF4A、HSBP1和ALOX5）和5个GC下调的FRG（ATF3、CAV1、ANGPTL4、CDO1和ATG4D）为预后相关基因（图3A，B）。为了验证这些与GC预后相关的FRG的结果，我们分析了另一个具有相应生存数据的GC的转录组数据集（GSE62254）。结果显示，这12个FRG中的10个（LONP1、MYB、PSAT1、TP53、HNF4A、ALOX5、ATF3、CAV1、ANGPTL4和CDO1）在GSE62254数据集中也与预后明显相关，表明这10个FRG可能影响铁蛋白形成和GC的进展。

四个枢纽铁蛋白相关基因可能与CD4+T细胞活化有关

为了研究重要的FRG和GC的肿瘤微环境之间的关系，我们根据CIBERSORT计算了TCGA-STAD数据集中患者的不同免疫细胞浸润分数。我们发现，TCGA-STAD数据集中浸润的免疫细胞主要是CD4+记忆T细胞、CD8+T细胞、幼稚B细胞、Tregs等。其中，CD4+T细胞，包括Tregs、滤泡辅助T细胞、活化的记忆CD4+T细胞、静止的记忆CD4+T细胞和幼稚的CD4+T细胞，具有最高的免疫细胞浸润分数和最多的浸润患者（图4A，B）。GC患者的主要浸润免疫细胞类型可能是CD4+T细胞。其中，静止或激活的记忆型CD4+T细胞占了很大比例。随后，我们探讨了预后相关FRG的表达与不同免疫细胞浸润评分的皮尔逊相关系数。有趣的是，我们发现大多数GC预后相关的FRG与一个或多个免疫细胞浸润评分明显相关（图4C）。更有趣的是，四个GC上调的FRG（LONP1、MYB、PSAT1和TP53）与活化的CD4+T细胞浸润有明显的正相关（Pearson相关系数>0.1，P值≤0.01，图4C，D）。这表明，在胃癌发生过程中，枢纽FRG（PSAT1、LONP1、MYB、TP53）的高表达可能会促进活化的CD4+T细胞的增加。由于CD4+T细胞有助于CD8+T细胞的招募、增殖和效应功能，我们推测活化的CD4+T细胞可以促进GC中CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。我们的研究进一步显示，枢纽FRG的表达与静止的CD4+T细胞的浸润水平呈负相关（图4C），这表明枢纽FRG可能促进CD4+T细胞从静止到激活的转化，从而影响GC患者的预后。

枢纽铁蛋白相关基因、肿瘤微环境和临床特征的亚组分析

我们最初意识到，枢纽型FRG可能促进CD4+T细胞的激活，而激活的CD4+T细胞可能与GC患者的良好预后相关。为了进一步探讨枢纽FRG对GC样本分类、预后和治疗的影响，我们根据枢纽FRG基因的平均表达水平将TCGA-STAD GC患者分为高FRG评分组和低FRG评分组（图5A）。此外，为了评估FRG和肿瘤微环境之间的关系，我们使用CIBERSORT算法来检查免疫细胞的比例。计算每个病人的浸润分数，结果显示，高FRG分数组的静止CD4+T细胞浸润分数明显低于低的FRG分数组的浸润分数。高FRG组得分的活化CD4+T细胞浸润得分明显高于低FRG得分组（图5A）。此外，Kaplan-Meier曲线显示，高FRG组得分的总生存时间明显高于于低FRG组（图5B）。

长非编码RNA可以调控枢纽铁蛋白相关基因并作为潜在的干预目标

我们确定了可能通过促进CD4+T细胞的激活而对GC的良好预后做出贡献的枢纽FRG。然而，它们潜在的上游调控机制仍然是未知的。作为 "基因组的暗物质"，长非编码RNA（lncRNA）已被报道通过招募调控复合物、与RNA结合蛋白相互作用、干扰转录和其他机制来调节基因表达。为了研究枢纽FRG和lncRNAs的可能调控机制，我们根据基因表达的Pearson相关系数，进一步分析了与枢纽FRG相关的lncRNAs。我们首先筛选了TCGA-STAD数据集中的17,564个lncRNAs的表达。结果显示，701个lncRNAs有差异表达（564个明显上调，137个在GC组下调）（图6A）。其中共有36个基因与GC患者的预后显著相关（25个GC上调基因和11个GC下调基因）（图6B，C）。随后，我们根据相互作用网络中基因的连接性，构建了lncRNA-FRG相互作用网络（图6D,E）。其中，与枢纽FRG调控关系最强的三个lncRNA是A2M-AS1、C2orf27A和ZNF667-AS1（图6E）。由于它们与活化的CD4+T细胞浸润也呈负相关，我们证明这三个lncRNAs可能对枢纽FRG有潜在的负调控作用，进而抑制CD4+T细胞的活化。这三个lncRNAs的高表达与GC患者的预后不良有关（图6F）。因此，lncRNAs A2M-AS1、C2orf27A和ZNF667-AS1可能作为潜在的lncRNA靶点，用于调控铁蛋白酶、CD4+T细胞活化和GC的预后。有效的干预措施有助于促进GC患者的CD4+T细胞激活，提高免疫疗法的疗效。

写在最后

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