早！今天小编和大家分析一篇23年3月发表在Sci Rep（IF:4.6）杂志的文章《Bioinformatics analysis of rheumatoid arthritis tissues identifies genes and potential drugs that are expressed specifically》。作者从京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库和基因组富集分析（GSEA）中获得了159个坏死性凋亡相关基因，通过差异分析确定了113个与类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）相关的坏死性凋亡相关基因（NRDEGs）。随后，通过LASSO、RF和SVM-RFE三种机器学习算法，将FAS、MAPK8和TNFSF10确定为差异NRDEGs中的关键基因，发现关键基因在区分RA患者和健康对照方面具有良好的能力。通过靶向药物预测，预测到了48种针对关键基因的靶向药物和31个化学结构式。此外，还建立了基于关键基因的ceRNA网络，还通过免疫浸润发现FAS，MAPK8和TNFSF10可能与RA患者免疫微环境的变化有关。
背景
类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，具有侵袭性，涉及体内多个关节。全球患病率约为千分之五，女性的发病率通常比男性高2-3倍。RA的特征是疼痛、晨僵，导致关节侵蚀和破坏，产生肢体畸形。一些RA患者可能随后会出现累及关节以外器官的表现，例如皮肤类风湿结节、心包炎和间质性肺病变等，使RA成为一种多系统疾病。RA 的诊断主要基于临床症状、体征以及实验室和影像学检查。RA的发病机制涉及肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和细胞间基质等炎性细胞因子激活破骨细胞，导致RA患者软骨的破坏。RA的主要临床治疗包括生物制剂、非甾体抗炎药和糖皮质激素以及手术治疗，但目前仍缺乏针对RA滑膜的有效治疗靶点。因此，寻找RA的潜在治疗靶点至关重要。
坏死性凋亡是一种调节细胞死亡的新模式，已发现许多因素都会引发坏死性凋亡，包括肿瘤坏死因子（TNF）家族成员和其他病原微生物，抑制半胱氨酸蛋白酶 8（caspase 8）可抑制细胞凋亡并激活坏死，RIP1和 RIP3结合可形成一种复合物，能够诱导RIP3自身磷酸化形成坏死体，并转运至细胞膜，导致细胞膜破裂并最终破坏细胞。近期研究表明，坏死机制在骨科相关疾病（包括骨关节炎）的发病机制中起着十分重要的作用。在骨关节炎软骨中，坏死标志物RIPK1和 RIPK3在肿瘤坏死因子ɑ等炎症因子刺激后表达上调，而抑制坏死可显著减少关节软骨的破坏并延缓骨关节炎的进展，这有效证实了坏死在骨关节炎的进展中起着重要作用。有关RA和坏死组织的报道很少，其作用机制也尚不清楚。为了从坏死组织的角度进一步了解RA的发病机制，发现潜在的靶点非常重要。本研究评估了坏死性凋亡在RA发展中的作用。同时，研究了RA坏死性凋亡的潜在功能机制，以及NRDEGs关键基因与浸润免疫细胞之间的关系，更好地了解了RA进展中潜在的分子免疫过程。
方法：
1.从GEO数据库下载关于RA滑膜组织样本数据
2.坏死性凋亡相关差异基因的鉴定
3.NRDEG的富集分析
4.三种机器学习筛选关键基因
5.关键基因富集分析
6.免疫细胞浸润分析
7.关键基因药物预测和ceRNA网络的构建
8.关键基因的表达量验证
研究结果
坏死性凋亡相关差异基因的鉴定
从数据库中获得159个NRDEGs，通过差异分析确定了113个与RA相关的NRDEGs。在训练集中对113个NRDEGs进行差异分析，结果显示，在113个NRDEGs中，共有48个基因在RA样本和对照样本之间存在差异，其中36个基因上调，12个基因下调。聚类热图显示了RA样本和对照样本中NRDEGs的表达模式（图1A）。相关性分析显示了NRDEGs之间的相关性，FAS与MAPK8、BIRC、JAK2和STAT1呈正相关，而MAPK8与PYCARD、CASP1和TNFSF10呈负相关。有趣的是，IFNA1和IFNA8仅与FADD和PLA2G4C呈正相关（图1B）。
NRDEG的富集分析
对NRDEGs进行了GO和KEGG富集分析。GO富集结果显示，T细胞活化、质膜外侧和酰胺结合在RA中显著富集，而NRDEGs与细胞因子介导的信号通路、膜筏和细胞因子受体结合密切相关。其中，"膜筏 "的分子功能被普遍富集（图 2A，C）。此外，KEGG结果显示，“Epstein-Barr病毒感染”和 “人类T细胞白血病病毒1感染”在RA中显著富集，而NRDEGs则与“坏死”和“NOD-like受体信号通路”等通路密切相关（图2B,D）。总之，富集分析证据表明，NRDEGs可能通过调控“细胞因子介导的信号通路”、“膜筏”、“坏死”和“NOD样受体信号通路”在RA的发生发展中发挥重要作用。
三种机器学习筛选关键基因
鉴于RA患者与健康人之间的明显差异，对NRDEGs的诊断潜力进行了评估。为了区分RA患者，使用了三种机器学习算法（LASSO、SVM-RFE和RF）筛选训练集中的关键基因。在LASSO算法中，48个NRDEGs中选出了12 个基因（图 3A,B）。在SVM-RFE算法中，发现了19个 NRDEGs（图 3C,D）。RF算法确定了8个重要基因（图 3E-F）。最后，综合了三种机器学习算法的结果，确定了三个基因为关键基因（FAS、MAPK8 和 TNFSF10，图 3G）。为了研究这三个关键基因是否可用于区分RA样本和对照，绘制了ROC曲线， 结果显示关键基因的AUC均大于 0.85（图3H）。此外，还绘制了验证集的ROC曲线，以进一步验证关键基因的诊断潜力。结果显示，验证集中三个关键基因的AUC值也均大于0.8，表明这三个关键基因在区分RA样本和正常对照样本方面具有一定的准确性和特异性（图3I）。上述证据表明，关键基因在区分RA患者和健康对照方面具有较高的准确性和特异性。
关键基因的GSEA分析
对3个关键基因行GSEA富集分析，以了解它们在RA中的作用和意义。与3个关键基因富集相关的前六种途径如图所示，关键基因主要参与免疫应答（B细胞受体信号通路、T细胞受体信号通路、趋化因子信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用）和多种疾病通路（病毒性心肌炎、张力性关节炎、扩张型心肌病和肥厚型心肌病）（图4）。
免疫细胞浸润分析
为了研究RA患者和健康对照之间免疫微环境的差异，作者采用了CIBERSORT算法。如图所示，RA样本中浆细胞、T细胞CD8、T细胞滤泡辅助细胞和巨噬细胞M1的比例高于健康对照样本，而T细胞CD4记忆静息、NK细胞活化、单核细胞和肥大细胞活化在健康对照样本中表达更多（图5A）。此外，还分析了关键基因高低表达与免疫微环境的关系。FAS和MAPK8与它们呈显著正相关，而TNFSF10在免疫细胞T细胞滤泡辅助细胞、浆细胞、T细胞CD8、T细胞CD4记忆激活和γδT细胞中与它们呈负相关。FAS和MAPK8之间存在显著的负相关，TNFSF10与树突状细胞在休息时呈正相关（图5B-D）。基于这些证据表明FAS，MAPK8和TNFSF10三个关键基因可能强烈影响RA患者的免疫微环境。
关键基因药物预测和ceRNA网络的构建
通过在DGIdb 数据库挖掘可能靶向关键基因的药物，结果显示，共有48种药物靶向关键基因，其中19种靶向FAS，39种靶向MAPK8，没有发现TNFSF10 的相关靶向药物（图6）。此外，还通过 DrugBank 数据库检索了相关靶向药物的结构式，结果如图 7 所示，在预测的48种靶向药物中，共检索到31种化学结构式（图7）。此外，还利用starBase和Miranda数据库构建了 ceRNA 网络，如图8所示，该网络由238个节点（3 个关键基因、87 个 microRNA 和 148 个 lncRNA）和 264 条边组成。调控FAS的lncRNA包括59个竞争性结合 hsa-miR-650、hsa-miR-625-5p、hsa-miR-766-3p 和 hsa-miR-338-3p 的lncRNA。在ceRNA网络中，有20个lncRNA能与hsa-miR-93-3p、hsa-miR-1238-3p和hsa-miR-214-3p结合，以调控关键基因MAPK8。TNFSF10共有26个miRNA 参与调控（图8）。
关键基因的表达量验证
在训练集和验证集中对3个关键基因（FAS、MAPK10和TNFSF8）进行了表达量的验证。结果显示，训练集和验证集中3个关键基因的表达趋势一致。其中，MAPK10在RA患者中的表达量低于对照样本，而 FAS和 TNFSF10在 RA 样本中的表达量较高（图 9）。
