本次小编分享一篇2022年2月1发表于Chem Biol Interact的文献，题目为《Cathepsin B is a potential therapeutic target for coronavirus disease 2019 patients with lung adenocarcinoma》，影响因子5.192。这项研究的目的是确定COVID-19 LUAD患者远远严重于COVID-19患者的可能原因。
摘要：
2019冠状病毒病(COVID-19)被宣布为严重的全球公共卫生紧急事件。确诊为COVID-19的肺癌患者的住院率和死亡率高于其他癌症患者。然而，COVID-19肺腺癌(LUAD)患者的结果异常严重的原因仍不清楚。本研究旨在确定导致COVID-19 LUAD严重于COVID-19的可能原因，并确定COVID-19 LUAD患者的治疗靶点。我们利用癌症基因组图谱(TCGA)和基因表达综合(GEO)数据库以及各种生物信息学工具的公开数据，识别和分析LUAD患者中涉及SARS-CoV-2感染的基因。与SARS-CoV-2感染相关的分子二肽基肽酶4、基底素、组织蛋白酶B (CTSB)、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和肽基脯氨酸异构酶B的上调，而不是血管紧张素转换酶2的上调，可能是LUAD患者对SARS-CoV-2感染相对较高易感性的原因。CTSB在SARS-CoV-2感染后的LUAD组织中高表达，其表达与免疫细胞浸润及促炎细胞因子表达呈正相关。这些发现表明，CTSB在COVID-19 LUAD患者的超炎症反应中发挥了重要作用，是一种有希望的新型药物治疗COVID-19患者的靶点。
方法：
基因表达分析：
本文分析了来自Gene Expression Omnibus (GEO)的LUAD相关微阵列数据集，包括GSE31210(246个样本)、GSE27262(50个样本)、GSE7670(54个样本)、GSE19804(120个样本)、GSE118370(12个样本)、GSE43767(69个样本)、GSE32863(116个样本)、GSE68465(462个样本)、GSE12667(75个样本)、GSE63459(65个样品)、GSE72094(442个样品)、GSE43458(110个样品)、GSE10072(107个样品)、GSE19188(110个样品)。所有数据集经过数据过滤和归一化后进行合并。在每个数据集上采用ComBat方法降低批次效应。组间采用t检验进行统计学分析，P˂0.05为有统计学意义的差异。使用R v. 3.6.1中的“ggplot2”包进行基因表达测试和可视化。UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)用于确定LUAD组织中上述宿主基因的蛋白质和启动子甲基化水平。使用人类蛋白图谱(HPA, https://www.proteinatlas.org/)数据库中的免疫组化(IHC)分析验证LUAD和正常组织中的蛋白表达。
SARS-COV-2感染后CTSB表达分析：
为了探讨SARS-COV-2感染后CTSB的表达变化，我们使用公开的转录组数据集GSE152586、GSE177027、GSE152418和GSE171110来评估CTSB的表达。肺部CTSB表达的分析基于GSE152586数据集，该数据集包含SARS-CoV-2感染后48小时人类肺泡II型细胞类器官的转录组分析。对于动物模型，CTSB在仓鼠肺样本中的表达分析基于GSE177027数据集，该数据集包含SARS-CoV-2感染后第4天叙利亚仓鼠的转录组分析。重症COVID-19患者CTSB表达分析基于GSE152418和GSE171110数据集。GSE152418的原始read数采用转录本每百万次(TPM)方法归一化，GSE171110的原始read数采用日志每百万次读取计数归一化。重症监护病房(ICU)的患者被认为患有严重的COVID-19。使用Graph Prism v. 6.0对CTSB表达进行图形化可视化。各组均值比较采用t检验，P˂0.05为差异有统计学意义。使用GSE158055数据集分析COVID-19患者CTSB表达水平。使用Blood Atlas数据库(https://www.proteinatlas.org/humanproteome/blood)检测血液免疫细胞中CTSB的表达，包括B细胞、T细胞、树突状细胞(DCs)、单核细胞和粒细胞。
蛋白质相互作用(PPI)网络构建：
PPI网络数据使用检索相互作用基因(STRING)数据库(http://string-db.org)获得，并使用Cytoscape v. 3.6.1 (https://cytoscape.org/download.html)进行可视化。
基因表达相关性分析：
R v. 4.0.5 (R Core Team, Vienna, Austria)用于计算重症COVID-19患者外周血单个核细胞(PBMCs)中CTSB与其他基因表达水平的相关性。为此，对GSE152418数据集确定Spearman的相关系数。TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)根据基因表达谱预测肿瘤浸润免疫细胞的丰度。使用TIMER分析CTSB表达与B细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、DCs、中性粒细胞和巨噬细胞等免疫浸润丰度的相关性。
基因功能富集分析：
为了确定显著丰富的功能通路，使用Metascape (https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)对与重症COVID-19患者CTSB表达呈正相关的KEGG通路和GO分类进行了可视化分析。与CTSB表达呈正相关的基因在TRRUST(https://www.grnpedia.org/trrust/)中被识别出来。
细胞比例分析及细胞类型间CTSB表达差异：
GEPIA（http://gepia2.cancer-pku.cn/)根据TCGA和GTEx数据集中LUAD和正常肺组织样本的RNA-Seq表达数据，分析细胞类型比例和细胞类型之间的差异CTSB表达。CIBERSORT被用作反褶积工具，没有标准化。方差分析用于分析CTSB的差异表达。
预后价值分析：
使用PrognoScan数据库分析肺癌患者CTSB表达水平、总生存率（OS）和无复发生存率（RFS）之间的关系(http://www.abren.net/PrognoScan/)。采用Cox比例风险比（HR）和95%置信区间（CI）进行对数秩检验
统计分析：
根据PrognoScan数据库，生存分析结果以危险比（HRs）和对数秩检验P值表示。使用R v.3.6.1软件，通过斯皮尔曼的等级相关系数（r）评估两个变量之间的相关性。t检验用于比较两个独立样本与GraphPrism的差异。P<0.05被认为具有统计学意义。
结果：
与正常肺组织相比，LUAD中除ACE2外，其他SARS-CoV-2感染相关分子的mRNA和蛋白质表达上调：
SARS-CoV-2感染涉及多种感染相关分子，我们根据GEO数据库中的微阵列数据，分析了391个相邻正常组织和1647个LUAD组织样本中的转录谱。与正常组织相比，LUAD组织中ACE2、BSG、CD209、CCR5、CTSB、DPP4、FURIN、MTHFD1、TMPRSS4、PPIA和PPIB表达上调（图1A）。这种差异表达可能有助于观察到LUAD患者对SARS-CoV-2感染的易感性。进一步分析显示，LUAD组织中DPP4、BSG、CTSB、FURIN、MTHFD1和PPIB的蛋白水平较高，而CD209和TMPRSS4的蛋白水平低于正常组织。相比之下，SARS-CoV-2主要受体ACE2在正常肺组织和LUAD组织中的表达水平没有显著差异（P>0.05）（图1B）。此外，IHC染色证实，LUAD组织中DPP4、BSG、CTSB、MTHFD1和PPIB水平相对升高。感染SARS-CoV-2的男性患者的疾病严重程度和死亡率高于女性患者。为了确定上述基因与观察到的临床特征之间的关联，我们测量了男性和女性LUAD患者中前者的蛋白质水平。除DPP4表达外，大多数蛋白质的表达水平，尤其是CTSB（P<0.001）和PPIB（P<0.05），在男性患者中显著高于女性患者。DNA甲基化是基因激活中的一个重要事件。我们调查了导致LUAD中BSG、CTSB、PPIB、DPP4和MTHFD1上调的因素。BSG、PPIB、DPP4和MTHFD1表达升高与较低的DNA甲基化水平有关，尤其是后两个基因，其表现出统计学上的显著变化（P<0.05和P<0.0001）（图1C）。这一发现表明BSG、PPIB、DPP4和MTHFD1启动子的低甲基化可能会诱导这些基因在LUAD中的表达。然而，CTSB上调伴随着DNA甲基化的升高（图1C）。因此，DNA甲基化可能不会导致CTSB异常表达。
图1.SARS-CoV-2感染相关基因的表达水平。
SARS-CoV-2感染后CTSB显著上调，可能与COVID-19患者的超炎症反应有关：
为了研究SARS-CoV-2感染相关基因在肺部的表达，我们分析了最近上传至GEO数据库存储库的公开可用的GSE152586和GSE177027转录组数据集。SARS-CoV-2感染后48h，人肺泡II型细胞类器官中CTSB显著上调(P < 0.05)， MTHFD1和PPIB显著下调(图2a)， BSG和DPP4未发生改变。感染SARS-CoV-2后4d, CTSB在仓鼠肺标本中持续显著上调(P < 0.001)。相比之下，这些组织中的其他基因与人体器官中的基因表达不同(图2B)。
图2.SARS-COV-2感染后肺部BSG、CTSB、DPP4、MTHFD1、PPIB表达分析
我们利用STRING数据库鉴定了与CTSB相互作用的蛋白，并阐明了CTSB在COVID-19进展中的分子机制。PPI网络显示，CTSB与参与抗原处理和呈递以及炎症反应的蛋白质相互作用，包括HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DQB1、CD74、NLRP3、PYCARD、CASP1、CSTA、CTSD和CTSL（图3A）。在巨噬细胞中，NLRP3炎症小体通过与CTSB相互作用而被激活。NLRP3炎症小体失调导致严重的COVID-19症状、组织损伤和细胞因子风暴(CS)。为了探讨异常细胞因子的释放是否与CTSB有关，我们测定了血液中各种免疫细胞中CTSB的表达。CTSB在经典、中间和非经典单核细胞、浆细胞样细胞、髓系DCs和嗜碱性粒细胞中相对上调(图3B)。naive CD4+ T细胞和调节性T (Treg)细胞也表达出了可观的CTSB水平。因此，CTSB在各种先天和适应性免疫细胞中表达，特别是在经典单核细胞中。
图3.COVID-19患者CTSB与促炎细胞因子释放的相关性分析
我们分析了重症COVID-19患者PBMCs中CTSB表达与免疫细胞标志物集的相关性。CTSB与单核细胞、M1/M2巨噬细胞、CD8+ T、Th1、Th2、Tfh、Th17、耗尽的T细胞和dc呈正相关(表1)。
表1.重症COVID-19患者外周血单核细胞免疫细胞基因标记物与CTSB的相关性分析
我们分析了重症COVID-19患者PBMCs中CTSB表达与基因的相关性。GO和KEGG富集长期分析显示，与CTSB正相关的基因在与髓系白细胞活化和细胞因子产生调节相关的氧化石墨烯生物过程中富集(图3C)。这些与炎症反应密切相关。这些基因大多受到RELA和NF-κB1转录因子(tf)的调控，它们在促炎细胞因子的生物合成中发挥着关键作用。
COVID-19患者的超炎症反应与疾病严重程度和死亡率直接相关。为了建立CTSB表达与重症COVID-19患者之间的相关性，我们使用公开可用的转录组数据集GSE171110、GSE152418和GSE158055对前者进行了评估。在GSE171110和GSE152418数据集中，COVID-19患者中CTSB表达水平均有显著性升高(P < 0.01和P < 0.05)。此外，CTSB在老年和男性COVID-19患者中的表达高于年轻患者和女性人群(图4C和D)。这一发现与老年人和男性比其他亚人群更容易发展为严重的COVID-19的事实相一致。
图4.CTSB在COVID-19患者中的表达分析
在LUAD患者中，CTSB表达的升高促进了免疫细胞浸润，并与不良预后相关：
SARS-CoV-2诱导的CS是严重COVID-19患者死亡的主要原因。与正常肺组织相比，LUAD组织中T淋巴细胞和b淋巴细胞的积累更多。我们使用GEPIA数据库比较正常肺和LUAD组织中免疫细胞的比例。激活的NK细胞、树突状细胞、B细胞、血浆、CD8+ T细胞、助滤泡T细胞和调节性T细胞，尤其是M0、M1和M2巨噬细胞在LUAD中比在正常肺组织中更为丰富(图5A)。我们还比较了LUAD和正常肺组织中各种细胞类型之间的相对CTSB表达。在LUAD组织中，CTSB的表达与免疫细胞比例呈正相关。与正常肺组织相比，CTSB在LUAD组织的免疫细胞中过表达(图5B)。M0、M1和M2巨噬细胞的CTSB表达水平较高，且LUAD中CTSB的表达比例高于正常肺组织(图5)。因此，我们推测CTSB与LUAD中的免疫浸润有关。
图5.基于GEPIA的细胞比例分析及CTSB在正常肺和LUAD组织中的差异表达
我们计算了COVID-19 LUAD患者中CTSB表达与免疫细胞浸润之间的相关性。在LUAD组织中，CTSB表达与CD8+T细胞（r=0.303，P=7.86e-12）、CD4+T细胞（r=0.222，P=7.83e-07）、巨噬细胞（r=0.563，P=7.70e-42）、中性粒细胞（r=0.623，P=2.29e-53）和DC（r=0.601，P=2.53e-49）的浸润显著正相关（图6A）。
图6.CTSB水平升高促进了肺腺癌(LUAD)的免疫细胞浸润和细胞因子释放，并与不良预后相关。
>>>end
扫描二维码
关注我们